不同產地地參中17 種氨基酸的測定與分析

黃小蘭，何旭峰，楊 勤*，谷文超，周祥德，張 華，周 濃,*

（1.重慶三峽學院生物與食品工程學院，三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404100；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100；3.重慶三峽醫藥高等專科學校中醫學院，重慶 404100）

地參為唇形科地筍屬植物毛葉地筍（Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel）的干燥根莖，是一種傳統的藥食兼用佳品，可炒食、油炸、做醬菜等，堪稱蔬菜珍品[1]。地參野生資源廣泛分布于我國大部分地區，人工栽培于云南、山東、廣西、江蘇、江西、重慶、浙江等省（市）[2]。目前有關地參的文獻報道主要集中在酚酸類[3-4]和多糖類[5]，研究表明，地參酚酸和多糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤、免疫調節等多種生物活性[6-7]。因此，地參備受人們關注，成為近年來保健食品、藥品等領域研究開發與應用的熱點。但地參除含有酚酸、多糖、萜類與甾體、黃酮類、揮發油、微量元素、粗蛋白外[8-10]，還含有豐富的氨基酸類化合物[11-12]。

氨基酸作為蛋白質的基本組成單元和人體的必需營養成分，不僅能判斷食品的營養狀況，而且作為食品加工或中藥炮制過程中參與美拉德反應的底物之一，同樣也關聯和影響著食品的風味和藥物的生理活性[13-14]。早期的研究表明地參中含有豐富的氨基酸成分，總含量可達2.72%，但研究停留在對云南產野生地參的粗略統計[11-12]，尚鮮見其深入的研究報道。因此，測定地參中氨基酸含量對地參的質量控制、開發利用具有重要意義。

近幾年來，較為普遍的氨基酸測定方法有氨基酸分析儀法[15-17]、液相色譜-質譜串聯法[18-19]、高效液相色譜法[20-21]，前2 種方法成本較高，普及度不高，高效液相色譜法操作簡單，成本較低，應用范圍廣，常用于實驗室常規檢測。由于氨基酸的分子質量較小，極性較強，沒有發色基團[22]，不利于直接檢測，雖有報道采用液相色譜-帶電氣溶膠檢測器直接測定氨基酸的含量[23]，但該法靈敏度低、重現性差，故通過衍生試劑給氨基酸添加發色基團更有利于檢測。目前常用的柱前衍生方法有異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）法、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺活化環氨基甲酸酯（6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC）法[24]、鄰苯二醛（o-phthalaldehyde，OPA）法[25]、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，FDNB）法[26]等。但AQC價格昂貴，OPA只能與一級氨基酸發生反應且衍生物質不穩定，FDNB法需要在避光條件下進行且毒性較大[27-28]，而PITC可與一、二級氨基酸同時反應，且價格便宜、操作簡單、衍生產物單一、穩定，成為柱前衍生化測定氨基酸的首選。

本研究采用PITC對地參氨基酸進行柱前衍生化，即在堿性條件下，氨基酸與PITC相結合生成具有紫外吸收的化合物[29]，利用高靈敏度的超高效液相色譜（ultrahigh performance liquid chromatography，UPLC）儀進行分離檢測，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析對不同產地地參樣品進行差異分析，以期為地參在食品、保健食品以及藥品的深入開發利用方面提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參自采或委托采集于云南騰沖（S1）、重慶萬州（S2）、江蘇徐州（S3）、山東菏澤（S4）、廣西玉林（S5）、云南大理（S6）6 個地參主要栽培基地，重慶三峽學院生物與食品工程學院鑒定為唇形科地筍屬植物毛葉地筍的干燥根莖。

天冬氨酸 成都德思特生物技術有限公司；16 種氨基酸標準品 合肥博美生物科技有限公司；氨基酸信息詳見表1。

表1 17 種氨基酸信息Table 1 Information about 17 amino acids tested in this study

鹽酸、三乙胺、苯酚、乙酸鈉、冰醋酸（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠；PITC（純度≥99%，蛋白測序級） 上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國默克公司；實驗用水為去離子超純水。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC H-Class UPLC儀（配有二極管陣列檢測器和Empower色譜工作站） 美國Waters公司；Milli-Q Advantage A10超純水機（電阻率≥18.2 MΩ·cm）美國Millipore公司；3-30KS型高速離心機 德國Sigma公司；MS3型渦旋混合器 德國IKA公司；SQP萬分之一電子天平 德國Sartorius公司；TurboVap LV氮吹儀瑞典Biotage公司；BPG-9240A精密鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

分別稱取17 種氨基酸標準品適量，用0.1 mol/L HCl溶液溶解，配制成不同質量濃度的標準品儲備液，詳見表1。分別吸取各標準儲備液適量于6 個10 mL量瓶中，用0.1 mol/L HCl溶液定容至刻度，得不同質量濃度的系列混合標準品溶液，待衍生化操作。

1.3.2 樣品溶液的制備

1.3.2.1 地參樣品的水解

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定方法》[30]，將地參樣品經50 ℃干燥，粉碎過35 目篩，備用。準確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）地參粉末于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，繼續向頂空瓶內加入苯酚3 滴，立即密封。將頂空瓶置于110 ℃的電熱鼓風干燥箱內水解22 h后，取出，冷卻至室溫，濾過，用少量純水多次沖洗殘渣并轉移至25 mL量瓶中，加純水定容至刻度，混勻。取地參水解液0.4 mL于氮吹管中，在50 ℃水浴條件下氮吹至近干，加入0.4 mL純水復溶備用。

1.3.2.2 氨基酸衍生化

精密移取1.3.2.1節復溶后的水解液0.4 mL于10 mL離心管中，分別加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液和0.1 mol/L PITC-乙腈溶液各0.2 mL，混勻，室溫靜置60 min后，加入正己烷1 mL，渦旋混合器振蕩1 min，8 000 r/min冷凍離心5 min，萃取反應過剩的PITC，棄上層正己烷，將下層溶液用純水定容至2 mL量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3.3 空白溶液的制備

取0.1 mol/L鹽酸溶液0.4 mL于10 mL離心管中，自“分別加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液和0.1 mol/L PITC-乙腈溶液各0.2 mL”起照1.3.2.2節方法進行衍生化處理，即得。

1.3.4 色譜條件

A C Q U I T Y U P L C B E H C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；檢測波長254 nm；柱溫40 ℃；進樣量1 μL；流速0.2 mL/min；流動相：A為0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈（97∶3，V/V）溶液（冰醋酸調pH 6.5），B為80%乙腈溶液；梯度洗脫：0～1 min，94% A，6% B；1～15 min，94%～65% A，6%～3 5% B；1 5 ～2 2 m i n，6 5%～4 0% A，35%～60% B。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對測定數據進行處理，氨基酸含量以表示。采用SPSS 20.0軟件對數據進行PCA和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 衍生試劑用量的優化

氨基酸的衍生反應屬于競爭性反應，只有足夠的衍生試劑才能保證所有氨基酸充分衍生化。本研究取最高濃度的混合標準溶液0.4 mL，加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液0.2 mL，渦旋混勻，分別加入衍生試劑0.1 mol/L PITC-乙腈溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL進行衍生化反應，通過各氨基酸衍生產物的峰面積確定最佳用量。結果表明：當衍生試劑超過0.2 mL時，峰面積增幅不明顯，考慮到過量的PITC會造成色譜柱的損壞[26]，故本研究選擇衍生試劑用量為0.2 mL。

2.2 水解液酸堿度調節

氨基酸需在堿性條件下（約為pH 9）與PITC發生反應生成具有紫外吸收的氨基酸衍生物[26]，故地參水解液pH值的調節尤為重要。本研究比較用NaOH溶液調節pH值至中性和氮吹法除掉HCl溶液2 種方式，結果發現：用NaOH溶液調節pH值的過程中生成了大量的NaCl，當加入三乙胺-乙腈溶液和PITC-乙腈溶液后，出現分層現象，衍生試劑與目標物無法充分接觸，造成反應不完全。而采用氮吹法除HCl溶液能完全避免這種現象，保證氨基酸完全衍生。在上述優化后的條件下對標準品和樣品進行衍生化處理，按1.3.4節色譜條件注入UPLC儀進行測定，如圖1所示，各色譜峰峰形尖銳，分離度良好。

圖1 氨基酸標準品（A）與地參樣品（B）UPLC圖Fig. 1 UPLC chromatograms of mixture of 17 amino acid standards (A) and amino acids in hydrolysate of L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel (B)

2.3 線性關系、檢出限結果

表2 17 種氨基酸的標準曲線、線性范圍、相關系數、檢出限、定量限、儀器精密度和方法重復性Table 2 Calibration curves, linear ranges, correlation coefficients,limits of detection, limits of quantitation, instrumental precision and method repeatability for amino acids detected by UPLC

取1.3.1節的17 種氨基酸混合標準工作液按照1.3.2.2節方法進行衍生化處理，以1.3.4節色譜條件依次進樣分析，記錄色譜峰峰面積，以各氨基酸標準品的峰面積（Y）與其相應的質量濃度（X）繪制標準曲線，根據信噪比計算檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。如表2所示，17 種氨基酸的相關系數均大于0.999 0，表明線性關系良好；檢出限為0.020～0.110 μg/mL，定量限為0.067～0.368 μg/mL，表明儀器靈敏度高，可檢測較低質量濃度的氨基酸。

2.4 儀器精密度結果

取同一混合標準品衍生化溶液按照1.3.4節色譜條件連續進樣6 次，記錄17 種氨基酸峰面積并計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），見表2。結果顯示：各氨基酸峰面積的RSD在0.11%～2.32%之間，均小于3.00%，表明儀器精密度良好，可進行樣品分析。

2.5 方法重復性結果

精密稱取樣品（S6）0.5 g，平行6 份，按照1.3.2節制備樣品溶液，并按1.3.4節色譜條件進樣測定，記錄17 種氨基酸峰面積并計算RSD，見表2。結果顯示：各物質峰面積RSD在0.27%～2.25%之間，表明該方法的重復性良好，可用于地參樣品中氨基酸的含量測定。

2.6 衍生產物穩定性結果

取同一混合標準品衍生化溶液，分別在0、2、8、14、20、24、28、32、36 h時間里按照1.3.4節色譜條件進樣，結果顯示：各衍生產物隨著時間的延長，標準品質量濃度呈下降趨勢，在32 h內測得17 種氨基酸RSD在0.30%～2.63%之間，均小于3.00%；超過32 h后，部分氨基酸RSD超過3.00%。表明氨基酸衍生產物隨著時間的推移發生了降解，為了保證結果的準確性，衍生化處理完畢后保證在32 h內完成檢測。

2.7 加標回收實驗結果

表3 17 種氨基酸回收率結果（n=6）Table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked into sample (n= 6)

根據本實驗方法，稱取已測得氨基酸含量的地參樣品（S6）0.25 g各6 份，置于頂空瓶中，分別加入各標準品儲備液適量，按照1.3.2節方法制備衍生化溶液，按1.3.4節色譜條件測定峰面積，計算回收率和RSD，以平均值表示，結果見表3。結果表明17 種氨基酸平均回收率為89.69%～106.02%，RSD為0.44%～2.60%，可以滿足地參中17 種氨基酸含量測定的要求。

2.8 地參樣品中氨基酸的含量測定

表4 不同產地地參中氨基酸含量（n=3）Table 4 Amino acid composition of samples collected from six differenthabitats (n= 3)mg/g

表5 地參氨基酸的物質的量比（n=3）Table 5 Molar ration of amino acid (n = 3)

取6 個不同產地地參樣品按照1.3.2節進行樣品溶液的制備，平行3 份，注入UPLC測定氨基酸含量，并計算各氨基酸組分間物質的量比，結果見表4、5。不同產地的地參酸水解液中均檢出17 種氨基酸，但氨基酸總量存在差異，介于19.463～81.663 mg/g之間，氨基酸總量為山東菏澤＞江蘇徐州＞云南騰沖＞云南大理＞廣西玉林＞重慶萬州，平均含量為50.679 mg/g，明顯高于紫蘇葉與紫蘇子[29]、霍山石斛[14]、橄欖[18]，與黨參[31]含量接近。地參所含氨基酸中含量最高的為天冬氨酸，為6.268～18.450 mg/g，平均含量為13.338 mg/g，其次是谷氨酸，含量為3.088～13.346 mg/g，平均含量為8.478 mg/g，分別占總氨基酸含量的26.32%和16.73%，這與前期對云南地產野生地參的研究[11-12]結果一致；含量較低的氨基酸為甲硫氨酸和半胱氨酸，甲硫氨酸含量為0.109～0.514 mg/g，平均含量為0.316 mg/g，半胱氨酸含量為0.306～0.572 mg/g，平均含量為0.431 mg/g。

從表4可知，6 個產地地參中包括7 種人體必需氨基酸，含量為5.298～23.831 mg/g，平均含量為13.956 mg/g。必需氨基酸含量從高到低依次為纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，含量最高的纈氨酸占氨基酸總量的5.36%，甲硫氨酸含量最低，占總量的0.62%。6 個產地地參按必需氨基酸含量排序為山東菏澤＞云南騰沖＞江蘇徐州＞云南大理＞廣西玉林＞重慶萬州。不同產地地參必需氨基酸與氨基酸總量的百分比為23.99%～29.36%，平均值為27.35%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的百分比為31.57%～41.57%，平均值為37.73%，與聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織標準中對氨基酸理想模式的規定必需氨基酸與氨基酸總量比值為40%和必需氨基酸與非必需氨基酸比值為60%[32]有一定差距，表現為地參營養價值不夠均衡。

藥用氨基酸種類齊全，包括甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和精氨酸9 種，含量為13.887～55.890 mg/g，平均含量為35.825 mg/g，占總氨基酸的比例為68.44%～74.16%，平均比值為70.96%，高于枸杞[33]、石斛[34]等中藥，與黨參[31]含量相當。結果顯示，盡管不同產地地參的藥用氨基酸含量相差較大，但其在總氨基酸中所占比例無明顯差異，與王曉媛等[34]對不同品種石斛的研究結果類似。其中天冬氨酸和谷氨酸作為地參中主要的藥用氨基酸，分別占藥用氨基酸總量的37.23%和23.67%，而谷氨酸和天冬氨酸作為對映體，在人體的氨基酸蛋白質代謝過程中具有重要的作用[35]。研究表明，谷氨酸作為中樞神經中的主要興奮性神經遞質可介導神經信號轉導，能改善學習和記憶能力[36]；同時谷氨酸被人體吸收后與血氨結合可解氨毒，具有保肝護肝的作用[37]。而天冬氨酸具有增強機體免疫力、消除疲勞、促進肝功能和保護心肌等生物活性，廣泛用于食品、保健食品、化妝品及工業原料中，需求量大[38]。在地參中精氨酸含量僅次于天冬氨酸、谷氨酸，達3.199 mg/g，有增強機體免疫功能、改善心腦血管等作用[31]。綜上所述，地參中富含各類藥用氨基酸為其開發成各種保健食品、藥品以及日常食用的藥膳提供了一定的抗病物質基礎。

由表5可知，地參檢出的17 種氨基酸組分間物質的量比存在差異，但廣西玉林和云南大理2 個產地之間相似度極高。

2.9 PCA結果

2.9.1 PC篩選及其貢獻率利用SPSS 20軟件對地參中17 種氨基酸進行PCA。如表6所示，從17 個氨基酸組分中提取出2 個PC（特征值＞1），PC1的特征值為15.210，特征貢獻率為89.473%，主要影響因子為脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸；PC2的特征值為1.176，特征貢獻率為6.917%，主要影響因子為精氨酸、蘇氨酸和谷氨酸；2 個PC的累計貢獻率為96.390%。

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

2.9.2 綜合PCA結果

表7 PC系數向量值Table 7 Vectors of principal components

表8 樣品PC得分、綜合得分及其排序Table 8 Principal component scores, comprehensive scores and their ranking

將表7中的系數向量值與17 種氨基酸含量標準化后的數據相乘，計算每個PC得分，根據每個PC所對應的特征值占所提取PC總特征值之和的比例作為權重得到綜合PC表達式為F=0.928F1+0.072F2，并進行排序。如表8所示，相對于PC1，采自山東菏澤的地參得分最高；相對于對PC2，采自江蘇徐州的地參得分最高；綜合得分排序由高到低依次為山東菏澤＞云南騰沖＞江蘇徐州＞云南大理＞廣西玉林＞重慶萬州。不同產地地參的F值為-1.426～1.485，表明不同產地地參間氨基酸含量差異明顯。

2.10 聚類分析結果

圖2 樣品聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of samples

采用SPSS 20.0軟件對6 份樣品進行聚類分析，結果見圖2。當歐式距離為15時，全部樣品被分成3 大類，其中山東菏澤的為第I類，營養價值最高，其余4 組為第II類，氨基酸品質含量中等，重慶萬州為第III類，品質相對較差，與PCA的結果一致。第I類山東菏澤地參為高品質蛋白，可作為地參資源開發與利用的理想資源；第III類為低品質蛋白，氨基酸含量可能與當地生態環境、種質資源等[2]有關。聚類分析結果較好地體現了不同產地間氨基酸含量的差異性，為地參營養價值、藥用開發提供理論指導。

3 結 論

本研究采用6 mol/L鹽酸溶液在110 ℃條件下對地參樣品進行水解，取水解液進行PITC柱前衍生，結合UPLC進行測定，計算得到地參中游離和水解氨基酸的總和。該方法的靈敏度高、分離效果好、精密度、重復性、穩定性和回收率良好，結果穩定可靠。分析地參樣品中氨基酸的組成及含量，可以為地參藥材質量評價和將其開發為保健品提供理論依據。

地參作為我國傳統藥食兩用的中藥材歷史悠久，其氨基酸種類豐富且含量較高，本研究中6 個不同產區的地參均含有17 種氨基酸，總含量約占地參質量的5.00%即50 g/kg，極具開發作為補充氨基酸的功能性食品的潛力，豐富市場；檢出氨基酸中含有7 種必需氨基酸和9 種藥用氨基酸，具有較高的營養價值和藥用價值，并通過PCA和聚類分析綜合評價，山東菏澤地參氨基酸總含量高，重慶萬州的相對較低。因此，建立地參栽培基地時，應充分考慮地參對產地的適應性。由于本實驗選擇的樣品產地僅限于5 個地參栽培省（市）并未包括我國所有地參產地，且樣本數量較少并不能完全代表當地地參品質，因此在今后研究中還需擴大采樣量和采樣范圍，調查生長環境和栽培技術，明確環境因素對地參氨基酸營養價值和藥用價值的影響，為地參品質評價、產品的深入開發利用提供更多依據。