源自螺旋藻渣枯草芽孢桿菌發酵抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素對金黃色葡萄球菌抑菌機制對比研究

付 云，趙謀明,2，龐一揚，劉小玲,*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中常見的食源性致病菌，廣泛分布于自然界中，容易污染乳制品、水產品和肉制品等食品，造成食物中毒，進而威脅人類的生命健康安全[1]。因此，有效抑制食品中金黃色葡萄球菌的生長繁殖、提高食品安全性，是對人類健康和生命安全的重要保障。

抗菌肽是一類天然的具有抗細菌或真菌作用的小分子生物活性肽，因有望成為新型天然食品防腐劑而備受關注[2]。作為天然來源的抗菌肽，與傳統的抗菌劑相比，其獨特的抑制病原微生物生長且不易產生耐藥性的機理已成為廣大學者的研究熱點。Powers等[3]研究發現抗菌肽polyphemusin可破壞大腸桿菌細胞膜，從而使菌體裂解死亡；陳飛龍等[4]研究發現抗菌肽F1能夠以嵌插方式與金黃色葡萄球菌的DNA結合，干擾其正常代謝，從而達到抑菌效果。然而，由于抗菌肽生產成本高昂，且對其抑菌機理研究尚不夠深入，限制了其在食品及農業生物防治等方面的應用發展[5]。

螺旋藻渣是螺旋藻粉生產過程中的沉積物，其蛋白質含量高、價格低廉。在本課題組前期研究中，采用枯草芽孢桿菌YA215發酵螺旋藻渣，發現其發酵產物具有顯著的抗金黃色葡萄球菌效果[6]，后續通過Sephadex LH-20凝膠層析柱和反相高效液相色譜法進行分離純化，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜從發酵產物中鑒定得到兩種抗菌多肽：一種是伊枯草菌素（iturin A），分子質量1 043.44 Da，為枯草芽孢桿菌自身代謝產物[7]；另一種是螺旋藻渣發酵過程中產生的新型抗菌肽，將其命名為SP-AP-1，分子質量1 422.60 Da，氨基酸序列為ATHDNCCLRQS。兩種抗菌肽iturin A和SP-AP-1對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為0.052 mg/mL和0.014 mg/mL，本實驗以金黃色葡萄球菌為指示菌，從細胞膜表面疏水性、細胞膜通透性、K+泄漏情況、蛋白質合成和基因組DNA遷移變化等方面探究兩種抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌機理，并比較其抗菌效果，以期為抗菌肽iturin A和SP-AP-1在食品和藥品領域中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

金黃色葡萄球菌CGMCC 14519由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

抗菌肽SP-AP-1（純度＞95%）由湖北普羅金科技有限公司合成；iturin A購自美國Sigma公司。

正十六烷、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 上海麥克林生化科技有限公司；曲拉通 北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；考馬斯亮藍R-250 天津市科密歐化學試劑有限公司；Nisaplin 丹尼斯克（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-6100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；ZEEnit700P原子吸收光譜儀 德國耶拿分析儀器股份公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；SCIENTZ-48L冷凍型高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋致微（廈門）儀器有限公司；ZQZY-85CS振蕩培養箱上海知楚儀器有限公司；Gel-Doc XRS免疫電泳成像系統美國Bio-Rad科技公司；RF-5301PC熒光分光光度計島津企業管理中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽對金黃色葡萄球菌生長的影響

參照孟兆麗[8]的方法并稍作修改，將Nisaplin、抗菌肽SP-AP-1和iturin A分別加入金黃色葡萄球菌菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL）中，使其終質量濃度均為1 MIC。37 ℃、200 r/min連續培養24 h，每隔2 h進行取樣，測定OD600nm，繪制生長曲線，以未加入抗菌樣品溶液的金黃色葡萄球菌作為空白對照。

1.3.2 抗菌肽對細菌細胞表面疏水性的影響

表面疏水性的測定參照Hou Lixia[9]和Pelletier[10]等的方法并稍作修改，采用0.02 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌對數期金黃色葡萄球菌并用0.1 mol/L KNO3溶液重懸（菌液濃度為108CFU/mL），依次將質量濃度分別為1、1/2、1/4、1/8 MIC的兩種抗菌肽溶液與菌懸液等體積混合，對照組為等量PBS。37 ℃、200 r/min培養30 min，測定OD405nm（OD0）；然后吸取體積為1.2 mL的菌懸液，向其中加入200 μL十六烷，25 ℃搖床混勻2 min，靜置15 min，直至菌懸液和十六烷兩相溶液完全分層，小心吸取水相，測定OD405nm（OD1）。細菌細胞表面疏水性按下式計算。

1.3.3 抗菌肽對細菌細胞內膜滲透性的影響

參照Ibrahim等[11]的方法并稍作修改，吸取1 mL對數生長期金黃色葡萄球菌菌液，8 000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀并用己滅菌的生理鹽水清洗兩次，然后將洗滌后的菌液加入到10 mL的M9乳糖誘導培養基中，37 ℃振蕩培養8 h，離心，洗滌菌體沉淀并用β-半乳糖苷酶反應緩沖液將其重懸，使其OD630nm在0.2左右。吸取重懸液1.6 mL，分別向其中加入200 μL 質量濃度為1 MIC的兩種抗菌肽溶液，再加入200 μL質量濃度為1 mg/mL的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，混合均勻，37 ℃水浴5 h，間隔1 h測定OD405nm的變化情況，陰性對照為PBS，陽性對照為曲拉通。

M9乳糖誘導培養基（以1 L滅菌水計）：乳糖5 g、Na2HPO4·7H2O 12.8 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1 g、KH2PO43 g、CaCl20.01 g、MgSO40.5 g，121 ℃、0.1 MPa濕熱滅菌15～20 min。

β-半乳糖苷酶反應緩沖液（以1 L滅菌水計）：Na2HPO4·12H2O 2.9 g、NaCl 8 g、KH2PO40.24 g、KCl 0.2 g、MgSO40.25 g、β-硫基乙醇0.39 g。

1.3.4 抗菌肽對細菌細胞內K+泄漏的影響

將金黃色葡萄球菌菌懸液（ 菌液濃度為108CFU/mL）分別與質量濃度1 MIC的兩種抗菌肽混合，37 ℃孵育一定時間，10 000 r/min離心10 min，對照組為金黃色葡萄球菌菌懸液（菌液濃度為108CFU/mL，不添加任何抗菌肽溶液），采用原子吸收光譜儀測定上述上清液中K+質量濃度的變化情況，每隔10 min記錄一次，共記錄7 次。

1.3.5 抗菌肽對細菌胞內蛋白質合成的影響

1.3.5.1 菌體胞內蛋白質相對含量的測定

參照郭娟等[12]的方法，將培養至對數生長期的金黃色葡萄菌10 000 r/min離心15 min，收集菌體并重懸為108CFU/mL菌懸液，在100 mL菌懸液中分別加入質量濃度0.5 mg/mL的SP-AP-1和iturin A（終質量濃度均為1 MIC）和質量濃度0.5 mg/mL Nisaplin，對照組加入等體積無菌蒸餾水，37 ℃恒溫培養，分別取間隔培養1 h的菌懸液10 mL，離心，收集菌體沉淀并用PBS洗滌兩次。將沉淀轉移至研缽，液氮研磨，加入500 μL 20 g/100 mL三氯乙酸和400 μL超純水，冰浴10 min后離心取沉淀。用10 g/100 mL三氯乙酸再次重懸取沉淀，將菌體轉移至無菌試管中，加入100 μL生理鹽水重懸，再加入5 mL考馬斯亮藍染色液，室溫放置30 min后在595 nm波長處測定OD595nm。

1.3.5.2 菌體蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

將培養至對數生長期的金黃色葡萄球菌用LB液體培養基培養液重懸后，分別加入兩種抗菌肽溶液（質量濃度設置：1 MIC和5 MIC），為確保實驗準確性，本實驗采取兩次對照（加入等體積的無菌蒸餾水），37 ℃、200 r/min培養8 h，8 000 r/min離心20 min，收集菌體，向菌體沉淀中加入500 μL PBS和0.3 g石英砂，8 000 r/min離心4 min，收集上清液，取20 μL上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.6 抗菌肽對金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響

參考寧亞維等[13]的方法并稍作修改。采用DNA提取試劑盒對金黃色葡萄球菌基因組DNA進行提取，利用凝膠阻滯法觀察SP-AP-1和iturin A對金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響。將金黃色葡萄球菌基因組DNA與質量濃度分別為1、2、3 MIC和4 MIC的兩種抗菌肽溶液按照體積比1∶1混合，對照組為金黃色葡萄球菌基因組DNA（不添加抗菌肽溶液），總反應體積為4 μL。充分混勻后，37 ℃恒溫水浴60 min。反應結束后，用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察并分析基因組DNA的遷移結果。

1.3.7 抗菌肽作用于細菌細胞膜時二級結構的變化

分別采用30 mmol/L SDS溶液和10 mmol/L PBS將兩種抗菌肽配制成質量濃度為0.5 mg/mL的溶液，在石英比色皿中加入一定體積的抗菌肽溶液，25 ℃下用圓二色光譜儀對樣品進行180～260 nm的遠紫外掃描并采集數據，掃描速率50 nm/min，帶寬1.0 nm。對掃描后的所有圖譜用CDNN軟件進行減噪處理并對樣品溶液的二級結構相對含量進行擬合計算。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3 次，實驗數據采用SPSS Statistics 19軟件與Origin 9.1軟件進行統計分析，以平均值±標準差表示。采用Duncan法進行顯著差異性比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽對金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖1可知，添加抗菌肽SP-AP-1和iturin A的金黃色葡萄球菌菌液在培養4 h后其生長曲線均發生明顯變化，菌液質量濃度逐漸降低，8 h后OD600nm逐漸趨于穩定，而對照組菌落生長正常，無明顯變化，表明兩種抗菌肽均能夠在金黃色葡萄球菌的對數生長期內抑制其生長繁殖，且SP-AP-1比iturin A有更強的抑制作用。

圖1 抗菌肽對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.1 Effects of antimicrobial peptides on the growth of S.aureus

2.2 抗菌肽對細菌細胞表面疏水性的影響

正十六烷是一種有機相，金黃色葡萄球菌在水相和有機相中的吸附率是不同的，因此，細菌細胞表面疏水性的改變可由吸附率來反映[14]。如圖2所示，當抗菌肽SP-AP-1和iturin A作用于金黃色葡萄球菌后，各組間和組內的細胞吸附率均存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，經iturin A處理后，金黃色葡萄球菌細胞吸附率從PBS組的77.3%降為37.6%，而經SP-AP-1處理的菌液細胞吸附率僅為33.5%，兩種抗菌肽對金黃色葡萄球菌細胞吸附率的影響均呈濃度依賴性。有研究表明，細胞表面疏水位點主要為蛋白質-脂類和糖-脂類等物質[15]，故推測細胞表面疏水性降低的可能原因為抗菌肽與金黃色葡萄球菌細胞表面相互作用，吸引電負性基團造成重排，從而導致金黃色葡萄球菌細胞表面電負性增強，疏水性下降[16]。

圖2 抗菌肽對金黃色葡萄球菌細胞表面疏水性的影響Fig.2 Effects of antimicrobial peptides on the cell surface hydrophobicity of S.aureus

2.3 抗菌肽對細菌細胞內膜滲透性的影響

細菌經乳糖誘導后，其細胞內膜上能產生一種將乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的β-半乳糖苷酶[17]。鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷可作為乳糖替代物被β-半乳糖苷酶水解成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚，故通過測定反應體系中OD值來反映抗菌肽對細菌細胞內膜的破壞程度[18]。

圖3 抗菌肽對金黃色葡萄球菌細胞內膜通透性的影響Fig.3 Effects of antimicrobial peptides on the permeability of S.aureus cell membrane

由圖3可知，當抗菌肽作用于金黃色葡萄球菌后，兩種抗菌肽的OD405nm均隨時間的延長而增大，且在3 h時OD405nm達到最高，反應體系進行到5 h時，SP-AP-1組OD405nm顯著高于iturin A組（P＜0.05）。而在整個反應過程中，PBS陰性對照組基本無明顯變化，其OD405nm穩定在0.42左右，這表明添加SP-AP-1和iturin A對金黃色葡萄球菌細胞內膜造成了一定的損傷作用，導致其細胞內膜滲透性增大、通透性增強，底物鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷進入細胞內的數量增多，β-半乳糖苷酶催化分解速率加快，故黃色產物鄰-硝基苯酚增多，OD405nm增大。隨著時間的延長，由于β-半乳糖苷酶數量有限，催化分解的速率達到最大值時，OD405nm不再隨底物鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷的增加而增大，而是保持相對穩定的趨勢。這與趙廣旭[19]和張宇[20]自主設計的抗菌多肽具有類似作用效果，說明抗菌肽通過引起細菌細胞內膜通透性改變，達到抑制或殺死細胞的效果。

2.4 抗菌肽對細菌細胞膜內K+的泄漏影響

圖4 抗菌肽誘導金黃色葡萄球菌細胞內K＋釋放量的變化Fig.4 Effect of antimicrobial peptides on the release of intracellular potassium ions from S.aureus

細胞內K+的泄漏是離子泄漏的典型代表之一，其泄漏程度可反映抗菌肽作用于細胞時細胞膜的損傷程度[21-22]。由圖4可知，金黃色葡萄球菌經SP-AP-1和iturin A處理后，其胞內K+釋放量隨時間的延長均呈快速增長趨勢，而對照組變化不明顯，表明SP-AP-1和iturin A均能使金黃色葡萄球菌細胞膜通透性發生改變，且比較兩種抗菌肽的作用效果發現，SP-AP-1比iturin A對金黃色葡萄球菌細胞膜的透化作用更強（P＜0.05），這與2.3節中抗菌肽對細菌細胞內膜的滲透性影響結果相符，充分說明SP-AP-1和iturin A均能與金黃色葡萄球菌細胞膜相互作用，破壞其細胞膜的完整性，導致菌體死亡。然而SP-AP-1和iturin A引起金黃色葡萄球菌細胞膜完整性的破壞是否是導致其細胞死亡的主要原因還需進一步研究。

2.5 抗菌肽對細菌胞內蛋白質合成的影響

2.5.1 菌體胞內蛋白相對含量分析結果

圖5 抗菌肽對金黃色葡萄球菌胞內蛋白相對含量的影響Fig.5 Effects of antimicrobial peptides on intracellular protein content of S.aureus

由圖5可知，對照組胞內蛋白相對含量隨時間的延長而持續增加，且在10 h后保持穩定，而添加抗菌肽的實驗組金黃色葡萄球菌胞內蛋白相對含量均呈先增加后降低的趨勢。郭娟等[12]研究發現，抗菌肽與細菌作用后，短時間內細胞膜受損但尚未破裂，故其胞內蛋白相對含量表現出升高趨勢。添加SP-AP-1和iturin A的實驗組金黃色葡萄球菌胞內蛋白相對含量分別在4 h和6 h后急劇下降，且兩組具有顯著性差異（P＜0.05），這可能是因為金黃色葡萄球菌細胞膜的破裂導致胞內蛋白相對含量降低，也可能是由于抗菌肽進入細胞后使其DNA轉錄和翻譯過程受到抑制，因而菌體本身胞內蛋白含量降低[4]。

2.5.2 菌體蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

圖6 菌體蛋白SDS-PAGE分析結果Fig.6 SDS-PAGE analysis of the effect of antimicrobial peptides on intracellular proteins of S.aureus

由圖6可知，對照組胞內蛋白條帶完整清晰，而經抗菌肽SP-AP-1和iturin A處理后的實驗組金黃色葡萄球菌胞內蛋白出現不同程度的缺失現象。其中，蛋白條帶缺失較多的部分主要集中在分子質量17、20、25～35 kDa，說明兩種抗菌肽可影響金黃色葡萄球菌的基因轉錄或翻譯功能，進而抑制其蛋白質的合成，導致金黃色葡萄球菌胞內分子質量17、20、25～35 kDa之間的蛋白含量降低；同時，研究發現當兩種抗菌肽質量濃度從1 MIC增大到5 MIC時，分子質量在48～75 kDa之間的蛋白也會發生明顯的缺失現象，金黃色葡萄球菌的蛋白條帶清晰度明顯下降，顏色明顯變淺，特別是經質量濃度5 MIC抗菌肽SP-AP-1處理后，金黃色葡萄球菌胞內蛋白條帶幾乎沒有，說明增大抗菌肽SP-AP-1質量濃度，金黃色葡萄球菌胞內蛋白含量急劇降低，金黃色葡萄球菌胞內蛋白質的合成完全受到抑制。因此，SDS-PAGE實驗進一步表明抗菌肽進入金黃色葡萄球菌細胞后，抑制其胞內蛋白合成，從而導致菌體死亡，且高質量濃度的抗菌肽對金黃色葡萄球菌具有更強的抑制效果。陳飛龍等[4]研究了抗菌肽F1對金黃色葡萄球菌的胞內作用機制，也發現抗菌肽F1能夠造成分子質量20～30 kDa的蛋白含量降低，蛋白條帶顏色顯著變淺。

2.6 抗菌肽對菌體基因組DNA的影響

圖7 抗菌肽對金黃色葡萄球菌基因組DNA的影響Fig.7 Effect of antimicrobial peptides on genomic DNA of S.aureus

如圖7所示，不同質量濃度的抗菌肽SP-AP-1和iturin A作用于金黃色葡萄球菌后，菌體DNA條帶并未發生明顯的遷移現象，且部分DNA滯留于上樣孔內，這可能是因為電荷電負性發生改變或DNA雙螺旋結構改變，從而影響DNA遷移率[23-24]。增大兩種抗菌肽質量濃度，iturin A作用的金黃色葡萄球菌菌體DNA條帶遷移率和亮度沒有明顯變化，而SP-AP-1作用的金黃色葡萄球菌菌體DNA條帶亮度逐漸變暗、顏色變淺，這是由于抗菌肽與溴化乙錠競爭性結合DNA[25]，使金黃色葡萄球菌的基因功能受到影響，從而抑制其生長繁殖。Li Lirong等[26]研究發現細胞穿透肽衍生物可與溴化乙錠競爭性結合傷寒沙門氏菌DNA，從而導致菌體死亡；郭娟[12]和陳璇[27]等的研究也均證實了此觀點。因此，雖然兩種抗菌肽對金黃色葡萄球菌基因組DNA沒有明顯阻滯作用，但推測抗菌肽SP-AP-1可能與溴化乙錠競爭性結合DNA，使核酸合成受到抑制，而抗菌肽iturin A不能達到此效果。

2.7 抗菌肽作用于細菌細胞膜時二級結構的變化分析結果

抗菌肽的抑菌活性與其二級結構的變化密切相關[28]。圓二色光譜法是目前測定蛋白質二級結構、研究蛋白質在稀溶液中的結構和構象變化的較為準確和應用廣泛的方法之一[29]。本實驗利用圓二色光譜法對兩種抗菌肽在PBS和SDS疏水環境下的二級結構變化進行研究分析（圖8）。

圖8 兩種抗菌肽在PBS和SDS緩沖液中的圓二色光譜Fig.8 Circular dichroism spectra of two antimicrobial peptides in PBS and SDS buffers

表1 兩種抗菌肽二級結構的相對含量Table 1 Proportions of secondary structures in two antimicrobial peptides

兩種抗菌肽在不同環境下的二級結構相對含量見表1。當抗菌肽SP-AP-1處于PBS體系中時，其二級結構主要以無規卷曲（相對含量43.3%）為主；當抗菌肽SP-AP-1處于SDS緩沖液體系中時，其二級結構中無規卷曲相對含量減少，α-螺旋、反向平行、平行及β-轉角相對含量均有所增加，β-折疊（反向平行和平行）相對含量增加幅度最為明顯；而抗菌肽iturin A二級結構相對含量變化主要以β-轉角為主，當抗菌肽iturin A從PBS體系轉變到SDS緩沖液體系后，其二級結構中β-轉角相對含量從6.7%增加到27.5%。有研究表明，大部分抗菌肽通常在液體環境中的二級結構都是以無規卷曲為主，當抗菌肽接觸細菌細胞膜后，其結構或構象會發生一定程度的變化，這種構象變化與其抗菌活性緊密相關[30]。因此，本實驗中兩種抗菌肽在緩沖液環境及模擬膜的疏水環境下二級結構的變化間接反映了當抗菌肽作用于金黃色葡萄球菌時的抑菌機制。

3 結 論

本實驗以螺旋藻渣抗菌肽SP-AP-1和iturin A為研究對象，對比了兩種抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌機制。結果表明，iturin A主要通過引起金黃色葡萄球菌細胞膜通透性增加、抑制菌體蛋白合成，從而抑制菌體生長繁殖；而SP-AP-1對金黃色葡萄球菌的抑菌機制則是影響細胞膜通透性、抑制蛋白合成和競爭性結合DNA共同作用的結果，且其抑制效果比iturin A更為明顯，為進一步探究抗菌肽SP-AP-1的廣譜抗菌機制提供了一定的理論指導。