榆干離褶傘溶栓酶對大鼠動脈血栓的抑制作用

李芳芳，衛 瑩，劉 雪，沈明花

（延邊大學醫學院，吉林 延吉 133000）

血管內皮細胞的損傷及血小板的活化在血栓形成過程中起重要作用。血管內皮細胞不僅是血液與組織間的機械屏障，而且具有內分泌功能。它分泌的生物活性物質，如前列腺素I2、一氧化氮等在抗血小板聚集、抗凝血和纖溶方面起重要作用[1]。血小板是成熟的巨核細胞脫落下來的小塊胞質，參與機體的止血、炎癥等反應[2-3]。血小板異常活化與血栓形成密切相關[4]。在氧化應激、高糖等多種誘因的作用下，血管內皮細胞損傷時繼發血小板的活化[5]?；罨难“逋ㄟ^其膜表面的糖蛋白Ib與von Willebrand因子相結合，介導血小板的黏附和聚集，引發血栓的形成[6-7]。因此對血管內皮細胞的保護及抗血小板活化是預防或治療血栓形成的關鍵。

榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium），又名大榆蘑，主要分布于我國河北、吉林等地。榆干離褶傘發酵液具有抗氧化[8]、溶血栓[9]等作用。榆干離褶傘溶栓酶（Lyophyllum ulmariumfibrinolytic enzyme，LUFE）是從榆干離褶傘菌絲體中分離純化的分子質量為50 kDa的溶栓酶，在體外可以水解纖維蛋白及纖維蛋白原[10]。本課題組前期研究表明，LUFE對肝臟[11]、對氧化應激所致的血管內皮細胞損傷具有保護作用[12]。鑒于血管內皮細胞損傷和血小板的活化與血栓形成關系密切，本實驗一方面通過建立大鼠頸動脈血栓模型，觀察LUFE對血管內皮細胞及血小板活化的影響；另一方面在體外以膠原作為誘導劑，觀察LUFE對血小板的功能及其對磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路的影響，初步探討LUFE的抗血栓機制，為榆干離褶傘的生物學活性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

80 只清潔級SD大鼠，體質量180～220 g，雌雄各半，由延邊大學動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK（吉）2017-0003。LUFE及其粗提取物由延邊大學醫學院生物化學與分子生物學研究室提供。

可溶性血栓調節蛋白（soluble thrombomodulin，sTM）、E-選擇素、組織因子（tissue factor，TF）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）、P-選擇素、β-血小板球蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）和血小板膜糖蛋白IIbIIIa（glycoprotein IIbIIIa，GPIIbIIIa）試劑盒 上海嚴謹生物科技有限公司；藻紅蛋白（p-phycoerythrin，PE）標記的CD61、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的CD62P、FITC標記的同型對照免疫球蛋白（immunoglobulins G，IgG）1美國B D 公司； 膠原 美國S i g m a 公司；山羊抗兔IgG抗體 納川科技公司；p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）抗體、phospho-p38 MAPK抗體 艾博抗（上海）貿易有限公司；β-actin 美國CST公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀 美國Bio Tek公司；凝膠成像分析儀 美國UVP公司；流式細胞分析儀 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理

將大鼠隨機分為5 組，即假手術組、模型組、陽性對照組、LUFE低、高劑量組，每組10 只。陽性對照組按10 mg/kgmb灌胃阿司匹林，LUFE低、高劑量組分別按100、400 mg/kgmb灌胃LUFE粗提取物，連續7 d[10-11]。假手術組和模型組灌胃等量生理鹽水。最后一次灌胃30 min后麻醉大鼠（腹腔注射戊巴比妥鈉），建立頸動脈血栓模型[13]。頸部正中切口，鈍性分離、暴露右側頸總動脈，其底下墊1 cm×1.5 cm的透明薄膜以保護周圍組織。除假手術組外的其余各組均用0.5 cm×0.5 cm浸有質量分數20%三氯化鐵溶液的濾紙條包裹該段頸總動脈，假手術組用生理鹽水替代三氯化鐵溶液。20 min后拿下濾紙條，40 min后結扎透明薄膜兩端血管，按照薄膜長度剪下該段血管，并取出血栓，稱質量，按下式計算血栓抑制率。

式中：m1為模型組血栓濕質量/mg；m2為LUFE（或阿司匹林）處理組血栓濕質量/mg。

另取病變部位血管用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。大鼠心臟取血，室溫放置1 h后再置于4 ℃冰箱3 h，待凝血后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，用于相關指標的檢測。

1.3.2 sTM、E-選擇素、TF、TNFα、IL-6和PAF水平的測定

用酶聯免疫吸附法測定血清TNFα、IL-6、sTM、E-選擇素、TF和PAF水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 血管組織形態學觀察

將取下的動脈組織置于體積分數4%多聚甲醛溶液中固定，經體積分數70%～100%乙醇逐步脫水，透明、浸蠟包埋處理，切片后進行HE染色。最后于200 倍光學顯微鏡下觀察其結構變化。

1.3.4 流式細胞術檢測血小板CD62P水平

取2 支流式上樣管，各加入2 μL的CD61-PE，然后每管分別加入IgG1-FITC（對照）和CD62P-FITC各2 μL，再加入由磷酸鹽緩沖液稀釋20 倍的大鼠血液100 μL?；靹?，室溫下避光靜置15 min。然后加入預冷的體積分數1%多聚甲醛1 mL，4 ℃暗環境靜置30 min后測定血小板CD62P的熒光強度。

1.3.5 血小板血漿P-選擇素、β-TG和GPIIbIIIa水平的測定

取成年的健康SD大鼠，心臟采血5 mL，采用質量分數3.8%的枸櫞酸鈉抗凝血，使血液與抗凝劑的體積比例為9∶1，150×g離心10 min，上層為富含血小板血漿。繼續4 000 r/min離心10 min，即為貧血小板血漿，用貧血小板血漿重懸富含血小板血漿，調整血小板數為3×108個/mL。將上述血小板血漿分為4 組：對照組（Control）、膠原處理組（Collagen）、膠原+LUFE低劑量組（Collagen+LUFE-L）、膠原+LUFE高劑量組（Collagen+LUFE-H）。各組處理過程如下：Collagen+LUFE-L組和Collagen+LUFE-H組血小板血漿分別以質量濃度0.8、1.2 mg/mL的LUFE預處理10 min，然后在Collagen、Collagen+LUFE-L、Collagen+LUFE-H組中各加入質量濃度2 μg/mL的膠原，刺激5 min后用酶標儀測定各組的P-選擇素、β-TG和GPIIbIIIa水平。

1.3.6 Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達

洗滌血小板的制備[14]：同1.3.5節，取血后按體積比1∶1加入臺式（Tyrode）緩沖液，稀釋抗凝血。加入終質量濃度為50 ng/mL的PGE1，160×g離心15 min，收集上層富含血小板血漿。加入Hepes-Tyrode緩沖液，750×g離心10 min，棄上清液。用無Ca2+的Hepes-Tyrode緩沖液重懸血小板，并調整血小板數，制備3×108個/mL的洗滌血小板懸液。將血小板懸液分為4 組：對照組（Control）、膠原處理組（Collagen）、膠原+LUFE低劑量組（Collagen+LUFE-L）、膠原+LUFE高劑量組（Collagen+LUFE-H）。LUFE-L、LUFE-H組血小板分別以質量濃度0.8、1.2 mg/mL的LUFE預處理5 min后，分別將Collagen、Collagen+LUFE-L、Collagen+LUFE-H組血小板用質量濃度2 μg/mL的膠原刺激10 min，用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）終止反應。在各組血小板中分別加入蛋白裂解液，冰浴裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入上樣緩沖液，樣品在沸水中變性5 min。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白、電轉至PVDF膜。質量分數5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌后加入二抗（山羊抗兔IgG），室溫孵育1 h，沖洗后顯影。

1.4 數據處理與分析

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。多組間比較采用單因素方差分析，平均值間兩兩比較采用最小顯著差異法-t檢驗。P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 LUFE對大鼠血栓質量的影響

表1 LUFE對大鼠血栓質量的影響Table 1 Effect of fibrinolytic enzyme from Lyophyllum ulmarium on thrombus mass

如表1所示，模型組血栓質量為3.7 mg，假手術組無血栓形成，表明血栓模型建立成功。陽性對照組和LUFE低、高劑量組血栓質量較模型組顯著減?。≒＜0.05，P＜0.01），提示阿司匹林和LUFE在一定程度上能夠抑制大鼠動脈血栓的形成。

2.2 LUFE對大鼠血管組織形態學變化的影響

如圖1所示，假手術組頸動脈內膜結構完整，內皮細胞排列連續、規整，血管腔內未見血栓形成。模型組血管內膜的完整性被破壞，血管腔內可見紅細胞和大量血小板組成的混合血栓，并存在較多的炎性細胞。與模型組相比，陽性對照組和LUFE高劑量組血管內膜較光滑，雖然管腔內仍可見血栓形成，但栓體明顯縮小、疏松，血小板聚集程度減輕，炎性細胞數量減少。

圖1 LUFE對大鼠血管形態學的影響Fig.1 Effect of LUFE on carotid arterial vascular morphology in rats

2.3 LUFE對炎癥因子水平的影響

IL-6作為具有多種生物活性的促炎因子，不僅可以誘導高凝狀態，還可以促進內皮素的生成，引起血管壁損傷，從而促進血栓形成。PAF是由血小板、血管內皮細胞和中性粒細胞等在特異性刺激下釋放的一種具有廣泛生物活性的磷脂。PAF對血小板-中性粒細胞的活化過程有重要作用，是目前發現最強的炎癥因子和血小板聚集誘導劑[15]。如表2所示，與假手術組相比，模型組TNF-α、IL-6和PAF水平明顯上調，說明三氯化鐵溶液作用于血管壁以后能夠引起局部的炎癥反應。陽性對照組和LUFE高劑量組炎癥因子水平顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），并且LUFE高劑量組與陽性對照組之間無顯著性差異（P＞0.05），提示阿司匹林和高質量濃度的LUFE能夠抑制炎癥因子的產生或釋放。

表2 LUFE對TNF-α、IL-6和PAF水平的影響Table 2 Effect of LUFE on the levels of TNF-α, IL-6 and PAF

2.4 LUFE對血管內皮細胞損傷標志物的影響

TM是血管內皮細胞等多種細胞膜表面的跨膜糖蛋白。血漿中TM主要為損傷血管內皮細胞TM的降解產物，其水平可反映血管內皮損傷的程度，作為判斷血管內皮損傷的標準[16]。E-選擇素主要由內皮細胞合成，當內皮細胞活化或損傷時，其從細胞上脫落而進入血液。因此，可溶性E-選擇素也是內皮功能障礙的標志物[17]。TF是一種跨膜糖蛋白，是啟動體內凝血過程的重要因子及血栓形成的關鍵因素。正常情況下，血管內皮細胞和外周血細胞中檢測不到TF，但在血管內皮細胞受到損傷或受炎性因子刺激時可誘發性表達TF[18]，因此，TF也可以作為內皮細胞損傷的標志。如表3所示，血管內膜受到三氯化鐵溶液的刺激會引起血管內皮細胞的氧化損傷，模型組的sTM、E-選擇素和TF水平極顯著高于假手術組（P＜0.01）。而LUFE干預后能夠抑制sTM、E-選擇素和TF水平的上調，提示溶栓酶對血管內皮細胞具有保護作用。

表3 LUFE對sTM、E-選擇素和TF水平的影響Table 3 Effect of LUFE on the levels of sTM, E-selectin and TF

2.5 LUFE對血小板CD62P的影響

CD62P又稱P-選擇素，主要分布于血小板α顆粒和血管內皮細胞的棒狀管小體內，是血小板活化的特異性標志物[19]。在靜息狀態下，CD62P在血小板上極少表達。當血小板活化時，CD62P隨α顆粒釋放并與血小板膜融合，大量表達于血小板膜表面。如圖2所示，假手術組大鼠血小板CD62P的熒光強度為492.1±68.6，模型組CD62P熒光強度為807.6±127.3，明顯高于假手術組；而陽性對照組熒光強度（588.4±109.2）和高劑量組熒光強度（686.4±119.2）明顯低于模型組，提示阿司匹林和LUFE能夠抑制血管內膜炎癥反應所致的血小板活化。

圖2 流式細胞儀檢測血小板CD62P表達水平Fig.2 Expression level of CD62P on the surface of platelets measured by cytometry

2.6 LUFE對富含血小板血漿P-選擇素、β-TG、GPIIbIIIa水平的影響

在體外，以膠原刺激血小板后觀察LUFE對血小板活化標志物的影響。當血小板活化時，血小板膜表面的P-選擇素表達上調，并有部分釋放入血液，導致其水平升高。GPIIbIIIa是血小板膜上的糖蛋白，能夠與血管性假血友病因子或纖維蛋白原結合，參與血小板的聚集，促進血栓的形成。β-TG是血小板α顆粒中的特異性球蛋白，在誘導劑的作用下血小板被活化時其釋放增多，因此可作為血小板活化的指標[20]。如表4所示，經膠原刺激后，富含血小板血漿中Collagen組P-選擇素、β-TG和GPIIbIIIa水平顯著高于Control組（P＜0.05，P＜0.01），而經LUFE處理后能顯著降低P-選擇素、β-TG和GPIIbIIIa水平（P＜0.05，P＜0.01），提示LUFE能抑制膠原誘導的血小板活化。

表4 LUFE對富含血小板血漿P-選擇素、β-TG、GPIIbIIIa水平的影響Table 4 Effect of LUFE on the levels of P-selectin,β-TG and GPIIbIIIa

2.7 LUFE對血小板PI3K、Akt、p38 MAPK磷酸化水平的影響

PI3K/Akt、p38 MAPK信號通路參與小板活化過程[21]。如圖3所示，膠原刺激后，PI3K、Akt和p38 MAPK的磷酸化水平上調。經LUFE處理后可以下調PI3K、Akt和p38 MAPK的磷酸化水平。

圖3 LUFE對血小板PI3K、Akt和p38蛋白磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of LUFE on the phosphorylation levels of PI3K, Akt and p38 in platelets

3 討 論

血栓形成是缺血性心血管疾病和血栓栓塞性疾病的主要病理過程。內皮細胞損傷和血小板的活化是血栓形成的病理基礎。本實驗通過建立大鼠動脈血栓模型，從保護血管內皮細胞和抑制血小板活化角度探討了LUFE對血栓形成的抑制作用。

本實驗以三氯化鐵溶液外敷頸動脈的方法建立動脈血栓模型。三氯化鐵溶液中的高價鐵能夠氧化損傷血管內膜，引起內皮細胞的損傷。HE染色結果顯示，模型組血管內膜的完整性遭到破壞，管腔內可見炎癥細胞浸潤及血栓形成。血栓的形成導致局部缺氧，缺氧進一步加重血管內皮細胞的損傷，導致模型組大鼠sTM、E-選擇素和TF等血管內皮細胞特異性指標顯著上調。內皮細胞的損傷，一方面使膠原暴露引起血小板的活化；另一方面能引起局部血管的炎癥反應。有研究報道，血栓形成過程中并存炎癥反應[22-24]，而且這種炎癥反應和血栓的形成相互聯系、相互促進。本實驗以三氯化鐵溶液誘導血栓形成的過程中，模型組TNF-α、IL-6和PAF水平明顯高于假手術組，說明血栓模型建立過程中伴有炎癥反應，而且這種炎癥反應進一步損傷血管內皮細胞。PAF是由血小板、血管內皮細胞和中性粒細胞等多種細胞產生的一種促炎介質。研究報道，PAF與G蛋白偶聯受體結合后通過激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC），引起蛋白激酶C的活化和胞漿中Ca2+增加，繼而活化血小板并促進血栓的形成[25]。由此認為，模型組大鼠高水平的PAF可以活化血小板，促進血栓形成。流式細胞儀檢測結果表明，模型組大鼠的CD62P明顯高于假手術組，這可能與高水平的PAF有關（圖2）。經LUFE預處理后發現，其可以抑制血栓的形成（表1）、減輕血管內膜的病理改變、下調血管內皮細胞損傷標志物水平和血小板表面CD62P表達水平，提示LUFE可能通抗炎作用來保護血管內皮細胞，抑制血小板的活化和血栓的形成。本課題組前期研究發現，LUFE通過降低細胞內活性氧的水平對氧化應激損傷人血管內皮細胞有保護作用[12]，這與本實驗結果一致。

在動脈血栓形成過程中血小板的活化起關鍵作用。當血管發生炎癥或血管內膜損傷時內皮下膠原被暴露，血小板通過黏附、聚集作用并釋放血栓烷A2等生物活性物質，影響白細胞、血管內皮細胞的功能，并進一步激活血小板，從而促進血栓的形成。在動脈血栓形成的起始過程中，膠原與血小板的結合起關鍵作用[26]。因此，本實驗在體外以膠原誘導血小板的活化，觀察了LUFE對血小板活化的特異性指標的影響。結果表明，LUFE能夠下調膠原誘導的富含血小板血漿可溶性P-選擇素、β-TG和GPIIbIIIa水平，提示LUFE可能抑制血小板黏附、分泌及聚集過程。在膠原誘導的血小板活化過程中PI3K/Akt通路起重要作用[27-28]。血小板膜GPVI作為膠原受體，參與由膠原介導的PI3K/Akt信號傳導過程。膠原與GPVI結合后通過Src家族激酶激活免疫球蛋白Fc受體的免疫受體酪氨酸激活基序磷酸化位點，引起脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）的活化。Syk的活化進一步啟動下游信號級聯反應，包括活化T細胞跨膜連接蛋白的磷酸化和信號復合體的組裝。這種信號復合體包括磷酸化LAT在內的3 種蛋白，而這3 種蛋白與PI3K、三磷酸鳥苷交換因子等許多信號分子相關。這些信號分子對血小板GPVI信號通路中的磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）的募集和激活至關重要。如PLCγ2通過與PI3K產物-磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸結合促進其向質膜的募集。而這種PLCγ2向質膜的轉位對其活性很重要[29]?；罨腜LCγ2催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸產生二酰甘油和三磷酸肌醇。這2 種第二信使進一步激活下游信號分子引起血小板從內向外的信號傳導，最終作用于GPIIbIIIa，引起血小板的黏附及聚集反應[30]。Akt是PI3K下游的重要信號分子，它的磷酸化是PI3K信號通路的激活標志[31]。結果表明，LUFE抑制PI3K和Akt（Ser473）的磷酸化過程，提示LUFE可能通過PI3K/Akt信號通路，影響血小板PLCγ2的募集和激活過程，繼而影響血小板的功能。此外，在膠原誘導血小板激活的過程中，LUFE能降低p38 MAPK的磷酸化水平，提示p38 MAPK也是LUFE影響血小板功能的信號分子之一。

綜上，LUFE能夠抑制大鼠動脈血栓的形成，抑制機制可能與其抗血小板作用以及對血管內皮細胞的保護作用有關。