采前1-甲基環丙烯處理對貨架期‘Bartlett’梨虎皮病和抗氧化特性的影響

李英麗，張少穎，董 宇

（1.河北農業大學園藝學院，河北省梨工程技術研究中心，河北 保定 071001；2.美國俄勒岡州立大學，哥倫比亞農業研究與推廣中心，美國 俄勒岡 胡德里弗 97031；3.山西師范大學食品科學學院，山西 臨汾 041004）

‘Bartlett’梨是西洋梨的主要栽培品種之一，貯藏后易發生虎皮病，是限制其長期貯藏的主要因素。20世紀初，Brooks等提出了虎皮病的形成與自身代謝產生的揮發物質有關[1]。1966年，Huelin等證實了虎皮病與α-法尼烯合成密切相關[2]。后來的研究證明，果實表皮中共軛三烯的大量積累引起了虎皮病的發生，該物質是α-法尼烯的氧化產物[3]。然而許多研究也發現，不同蘋果和梨品種虎皮病的形成與果皮中α-法尼烯和共軛三烯的含量無顯著的相關性，與果實抗氧化能力密切相關[4-6]。抗氧化物質含量和抗氧化酶活性的降低導致膜脂過氧化，細胞結構完整性被破壞，多酚物質被氧化成醌類物質，果實表皮細胞積累大量醌類物質，導致虎皮病的發生[7-8]。目前，關于虎皮病發生的機理尚不清楚。

二苯胺和乙氧基喹可有效防止果實虎皮病的發生，但由于二苯胺殘留和乙氧基喹毒害問題，在許多國家已禁止使用[9-10]。目前，農業生產中廣泛應用采后1-甲基環丙烯（1-methylcyclopene，1-MCP）處理水果抑制虎皮病的發生。研究表明，采后進行1-MCP處理可有效抑制貯藏期間梨果實虎皮病的發生，提高果實硬度，減緩果皮葉綠素、可滴定酸含量的下降[11-13]。但采后1-MCP處理能夠影響西洋梨果實的后熟[14]，且對使用場所要求嚴格，處理后需要通風換氣。美國Agrofresh公司發明了一種懸浮劑型1-MCP（HarvistaTM），該產品對場地無特殊要求，可直接進行采前噴施，操作簡單、方便。許多研究表明，采前噴施1-MCP能延長采收期、提高果實貯藏性、降低虎皮病的發生率[15-16]。但關于采前1-MCP處理對果實抗氧化代謝系統的影響研究較少。本研究旨在探討采前1-MCP處理對‘Bartlett’梨貯藏后抗氧化物含量和抗氧化酶活性的影響，為今后虎皮病的調控提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗于2016年在美國俄勒岡州Parkdale的商品果園進行，供試品種為‘Bartlett’梨（Pyrus communisL.），20 年生，砧木為榅桲，栽植密度3 m×5 m。

懸浮劑型1-MCP（HarvistaTM） 美國Agrofresh公司。

1.2 儀器與設備

GC-8A氣相色譜儀 日本Shimadzu公司；900161便攜式二氧化碳測定儀 美國Bridge Analyzers有限公司；DA Meter水果成熟度無損檢測儀 意大利Sinteleia公司；高速冷凍離心機 美國Sigma公司；CO2壓力噴霧機 美國AgroFresh公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

選擇長勢一致、負載量相近的20 年生‘Bartlett’梨樹作為樣品樹，實驗采用完全隨機設計，每個處理6 棵樹，3 次重復。成熟前15 d（2016年7月29日）采用CO2壓力噴霧機噴施1-MCP溶液，每棵噴施2 L 300 mg/L 1-MCP溶液，以噴清水為對照。2016年8月13日采收，選取樹冠外圍東、南、西、北4 個方向的無機械損傷和病蟲害的果實，放入襯有微孔聚乙烯袋的木箱內，每個木箱70 個果實。果實采后4 h放入（－1.1±0.5）℃冷庫，相對濕度為90%～95%，貯藏一段時間后取出在常溫（20.0±1.0）℃下測定梨果實的虎皮病發生率和抗氧化活性，分別在室溫下放置1、3 d和5 d后進行測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 虎皮病病情指數測定

參考何近剛等[13]的方法，冷藏后每隔1 個月，將果實從冷庫中取出放置在室溫（20.0±1.0）℃條件下，放置1、3 d和5 d時觀察虎皮病發生情況。0級：無病斑；1級：病斑面積比小于1/4；2級：病斑面積比小于1/2；3級：病斑面積比大于1/2。每次處理30 個果，3 次重復。虎皮病病情指數按下式計算。

統計后的果實用于乙烯生成速率、呼吸速率和抗氧化性的測定。實驗發現，冷藏前3 個月無虎皮病發生，5 個月后虎皮病發生率較高，果實失去了商品價值，因此生理指標在冷藏4 個月后取出放在室溫下1、3、5 d后測定。

1.3.2.2 呼吸速率和乙烯生成速率測定

參考Xie Xingbin等[10]的方法測定呼吸速率和乙烯生成速率。選取5 個無損傷、大小均勻的果實，稱質量后放置在3.8 L的密閉罐內，3 次重復。密封1 h后，用便攜式二氧化碳測定儀測定密閉罐中的CO2質量，呼吸速率以每千克鮮果實每分鐘釋放的CO2質量表示，單位為μg/（kg·min）。然后抽取密閉罐上部1 mL的氣體，注入GC-8A氣相色譜儀中，用于測定乙烯質量濃度。檢測器溫度為140 ℃，進樣口的溫度為90 ℃，載氣N2的流速為0.8 mL/s，乙烯生成速率以每千克鮮果實每分鐘釋放的乙烯質量表示，單位為μg/（kg· min）。

1.3.2.3α-法尼烯、共軛三烯含量測定

參考Zhao Jing等[7]的方法測定α-法尼烯、共軛三烯含量。選取10 個無損傷、大小均勻果實，3 次重復，用水果刀削取帶1 mm厚果肉的果皮，用直徑1 cm的打孔器取20 片果皮，稱質量后放入50 mL離心管中，加入12 mL正己烷，避光振蕩提取30 min。取提取液于232 nm波長處測定吸光度以計算得到α-法尼烯含量，于281 nm和292 nm波長處測定吸光度以得到共軛三烯含量，單位均為μmol/kg。剩余果皮立即用液氮冷凍，貯藏在－80 ℃冰箱中，用于抗氧化活性、抗氧化物質含量、抗氧化酶活力和丙二醛含量的測定。

1.3.2.4 DPPH自由基清除能力、抗氧化物質含量的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和總黃酮、總酚和花青苷含量測定參考Dong Yu等[17]的方法。取1.0 g果皮加入預冷的7.5 mL提取液（V（乙醇）∶V（丙酮）＝7∶3），冰浴研磨，混勻后4 ℃、10 000×g離心20 min，上清液用于DPPH自由基清除能力、總黃酮和總酚含量的測定，單位均為mg/g。

花青苷含量測定：取0.5 g果皮，加入5 mL提取液（V（甲醇）∶V（鹽酸）＝99∶1），研磨、混勻，室溫（20.0±1.0）℃下避光放置24 h，然后在13 000×g離心5 min。取上清液，用紫外分光光度計測定530、620 nm和650 nm波長處的吸光度，單位為mg/kg。

1.3.2.5 抗氧化酶活力和丙二醛含量的測定

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力測定參照宋松泉[18]的方法。取1.0 g果皮，加5 mL提取液（含50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液、1%聚乙烯吡咯烷酮、1 mmol/L抗壞血酸、1 mmol/L乙二胺四乙酸），冰浴研磨，4 ℃、10 000×g離心20 min。取0.3 mL上清液，加入3 mL反應液（含50 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液、1 mmol/L抗壞血酸），最后加50 μL H2O2啟動反應，測定3 min內290 nm波長處的吸光度變化量，以不加H2O2作為對照。以每克樣品每分鐘吸光度減少0.01為1 個APX活力單位（U），單位為U/（g·min）。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定參考李合生[19]的方法。取果皮0.5 g，加3 mL pH 7.8磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，混勻后4 ℃、10 000×g離心20 min。取0.1 mL上清液，分別加入2.91 mL pH 7.0磷酸鹽緩沖液、50 μL愈創木酚和20 μL H2O2。每隔1 min讀取470 nm波長處的吸光度，測定4 min內的吸光度變化，以每克鮮樣品每分鐘吸光度減少1為1 個POD活力單位（U），單位為U/（g·min）。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定參考李合生[19]的方法。取果皮1.0 g，加3 mL pH 7.8磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，4 ℃、10 000×g離心20 min。取0.1 mL上清液，加入2.9 mL H2O2，反應15 s后測定240 nm波長處的吸光度，間隔30 s讀取吸光度，連續讀取6 個數據點。以每克樣品每分鐘吸光度減少0.01為1 個CAT活力單位（U），單位為U/（g·min）。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定參照郝再彬等[20]的硫代巴比妥酸比色法。取1.5 g果皮，加入5 mL、質量分數10%三氯乙酸溶液冰浴研磨，混勻后4 ℃、10 000×g離心15 min。取1 mL上清液，加入3 mL硫代巴比妥酸反應液，混勻后沸水浴20 min，然后立即放入冰水中冷卻。分別測定450、532 nm和600 nm波長處的吸光度，丙二醛含量單位為mmol/g。

1.4 數據統計與分析

利用WPS 2019軟件統計數據和作圖，運用SPSS 17.0軟件進行方差分析，利用T檢驗和Duncan's多重比較進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 1-MCP對‘Bartlett’梨虎皮病發生的影響

表1 1-MCP對‘Bartlett’梨虎皮病病情指數的影響Table 1 Effect of 1-MCP treatment on superfciial scald of ‘Bartlett'pears %

圖1 冷藏4 個月（A）和5 個月（B）后對照和1-MCP處理‘Bartlett’梨在室溫下放置5 d的虎皮病發生情況Fig.1 Appearance of control and 1-MCP treated‘Bartlett' pears after cold storage for 4 (A) or 5 (B) months

從表1、圖1可以看出，隨著貯藏時間的延長，虎皮病病情指數呈現上升的趨勢。貯藏前3 個月，果實沒有虎皮病的發生。貯藏4 個月后，室溫下對照組果實虎皮病病情指數呈現顯著上升的趨勢，而采前1-MCP處理的果實虎皮病發生率顯著低于對照組（P＜0.05），表明1-MCP處理可有效抑制虎皮病的發生。貯藏4 個月后室溫下放置5 d，1-MCP處理組果實未出現虎皮病癥狀，對照組果實虎皮病病情指數為8.48%。貯藏5 個月后室溫下放置3 d，2 個組別果實均出現虎皮病，室溫下放置3 d和5 d后，對照組虎皮病病情指數分別為33.32%和71.36%，1-MCP處理組分別為16.67%和31.98%，同時期這兩組的虎皮病發生指數均差異顯著（P＜0.05）。這表明1-MCP處理推遲了虎皮病發生時間并降低了病情指數。

2.2 1-MCP對‘Bartlett’梨α-法尼烯和共軛三烯含量的影響

從圖2A可以看出，室溫下放置1 d，對照組果皮中的α-法尼烯含量（339.12 μmol/kg）顯著高于1-MCP處理組（293.53 μmol/kg）。兩組α-法尼烯含量均在1～3 d下降，在3～5 d小幅升高。對照組和1-MCP處理組的α-法尼烯含量在3 d時最低，分別為189.20 μmol/kg和148.25 μmol/kg，5 d時分別升高至241.82 μmol/kg和198.93 μmol/kg。室溫下放置過程中，1-MCP處理組的α-法尼烯含量均顯著低于對照組（P＜0.05），這表明1-MCP處理可抑制α-法尼烯的合成。

如圖2B所示，室溫下共軛三烯含量的變化與α-法尼烯相似。冷藏4 個月后，對照組室溫下放置5 d共軛三烯的含量達到最高，此時果實發生虎皮病。室溫下1-MCP處理組的共軛三烯含量均顯著低于對照組，無虎皮病的發生。這表明1-MCP處理抑制了α-法尼烯的氧化，減少了共軛三烯的積累。

圖2 1-MCP處理對‘Bartlett’梨α-法尼烯（A）和共軛三烯（B）含量的影響Fig.2 Effect of 1-MCP treatment on the contents of α-farnesene (A)and conjugated trienes (B) of ‘Bartlett' pears

2.3 1-MCP對‘Bartlett’梨呼吸速率和乙烯生成速率的影響

圖3 1-MCP處理對‘Bartlett’梨呼吸速率（A）和乙烯生成速率（B）的影響Fig.3 Effect of 1-MCP treatment on respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of ‘Bartlett' pears

從圖3 A 可以看出，室溫下果實的呼吸速率呈現先升高后減低的趨勢。對照組和1-MCP處理組果實的呼吸速率均在室溫下放置3 d達到最高，分別為1 349.90 μg/（kg· min）和1 077.82 μg/（kg· min），1-MCP處理組顯著低于對照組水平；隨后對照組的呼吸速率快速下降，1-MCP處理組變化緩慢，表明1-MCP處理抑制了梨果實呼吸速率的上升。

如圖3B所示，對照組果實乙烯生成速率呈下降趨勢。室溫下放置1 d，對照組的乙烯生成速率達到最高值（88.98 μg/（kg·min）），顯著高于1-MCP處理組。隨后呈現下降趨勢，至5 d 時達到最低值（52.85 μg/（kg·min））。1-MCP處理組的乙烯生成速率在3 d時達到最高值（77.80 μg/（kg·min）），明顯低于對照組的乙烯高峰值，隨后變化不明顯。這表明1-MCP抑制了乙烯的形成，推遲了乙烯高峰出現的時間。

2.4 1-MCP對‘Bartlett’梨抗氧化活性的影響

圖4 1-MCP處理對‘Bartlett’梨抗氧化物質含量和抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of 1-MCP treatment on antioxidants and antioxidant activity of ‘Bartlett' pears

由圖4A可知，隨著室溫下放置時間的延長，對照組果實的DPPH自由基清除能力先增加后降低，在3 d達到最大值（5.39 mg/g），5 d時顯著低于1-MCP處理組。1-MCP處理組果實在室溫貯藏過程中DPPH自由基清除能力逐漸增加，室溫下放置1 d時為4.63 mg/g，顯著高于對照組（3.85 mg/g），5 d達到最高值（5.51 mg/g）。這說明1-MCP可以提高果實DPPH自由基清除能力。

如圖4B所示，室溫下梨果皮中的花青苷含量整體呈現上升的趨勢。室溫下放置1 d時對照組和1-MCP處理組的花青苷含量無顯著差異，5 d時1-MCP處理組的花青苷含量達到11.74 mg/kg，顯著高于對照組（8.90 mg/kg）。這表明1-MCP可提高果皮中花青苷水平。

從圖4C、D中可以看出，室溫下放置過程中，對照組果實中總黃酮和總酚含量總體呈現下降的趨勢。室溫下放置的前3 d，對照組和1-MCP處理組的總黃酮和總酚含量均呈下降趨勢，且無顯著差異；3 d后對照組的總黃酮和總酚含量持續下降，而1-MCP處理組呈上升趨勢，5 d時1-MCP組的總黃酮和總酚含量分別達到9.15 mg/g和3.91 mg/g，均顯著高于對照組。這表明1-MCP有利于貨架后期總黃酮和總酚類物質含量的增加，從而能增強后熟過程中果實的抗氧化能力。

2.5 1-MCP對‘Bartlett’梨抗氧化酶活力和MDA含量的影響

圖5 1-MCP處理對‘Bartlett’梨抗氧化酶活力和MDA含量的影響Fig.5 Effect of 1-MCP treatment on antioxidant enzyme activities and MDA content of ‘Bartlett' pears

APX、CAT和POD是生物體內重要的抗氧化酶，參與清除活性氧，從而提高生物體的抗逆性或延緩其衰老。從圖5A、B可以看出，隨著室溫下放置時間的延長，梨果實中的APX、CAT活力均呈現下降的趨勢。室溫下放置1 d時，對照組的APX、CAT活力分別為164.01 U/（g·min）和48.42 U/（g·min），顯著低于1-MCP處理組的194.93 U/（g·min）和72.91 U/（g·min）。至5 d時，對照組和1-MCP處理組的APX、CAT活力均差異顯著，其中對照組的APX和CAT活力分別下降至83.25 U/（g·min）和22.65 U/（g·min），與1 d相比降幅分別為49.24%和53.22%；而1-MCP處理組5 d時APX和CAT活力分別為111.75 U/（g·min）和47.70 U/（g·min），降幅分別為42.67%和34.58%。這表明1-MCP處理顯著提高了APX和CAT活力，減小了其下降幅度。

由圖5C可知，室溫下，對照組果實的POD活力呈現先升高后下降的趨勢，而1-MCP處理組的POD活力呈持續增加趨勢。室溫下放置1 d時，對照組和1-MCP處理組的POD活力無顯著差異，3 d時對照組的POD活力（11.36 U/（g·min））顯著高于1-MCP處理組（8.81 U/（g·min））。3 d后對照組的POD活力下降，而1-MCP處理組的果實POD活力持續上升。5 d時，1-MCP處理組的POD活力為18.65 U/（g·min），顯著高于對照組（8.02 U/（g·min））。這表明1-MCP處理可提高果實POD活力、推遲POD活力高峰出現時間、提高果實的抗氧化性。

從圖5D可以看出，室溫下梨果皮中MDA含量呈現增加趨勢。室溫下放置1 d，對照組和1-MCP處理組果皮中MDA含量處于較低水平，二者之間無顯著差異。隨后果皮中MDA含量呈現快速上升的趨勢。室溫下放置3 d和5 d時，對照組的MDA含量分別為4.89 mmol/g和5.40 mmol/g，1-MCP處理組分別為3.81mmol/g和3.74 mmol/g，顯著低于同時期的對照組（P＜0.05）。這表明1-MCP處理顯著抑制了MDA含量的增加。

3 討 論

‘Bartlett’梨是西洋梨優良品種之一，后熟時果肉細膩、多汁、香味濃郁，受到消費者的喜愛。一般冷藏條件下，‘Bartlett’梨的貯藏期為3 個月，之后果實易發生虎皮病，商品價值降低[21]。本實驗研究表明，冷藏前3 個月對照組和1-MCP處理組果實均沒有虎皮病發生，冷藏4 個月后室溫下放置5 d，對照組果實虎皮病病情指數為8.48%，1-MCP處理組無虎皮病發生。冷藏5 個月后對照組和1-MCP虎皮病發生指數急劇上升，其在室溫下放置5 d后發病指數分別為71.36%和31.98%，失去了商品性。這表明，采前噴施1-MCP可以降低冷藏期間‘Bartlett’梨虎皮病病情指數，推遲虎皮病發生時間1 個月，延長了貯藏期。

虎皮病是一種生理性病害，其發生與果皮中α-法尼烯的氧化產物共軛三烯密切相關[22-23]。α-法尼烯合成需要3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的轉錄與翻譯，該酶受乙烯的誘導[24]。1-MCP作為乙烯的競爭抑制劑可與乙烯受體結合，從而阻斷乙烯信號的傳遞[25]。有研究也表明，1-MCP通過影響乙烯合成基因的表達減少乙烯的合成[26]。因此，1-MCP可通過降低貯藏期間乙烯合成或阻礙乙烯信號轉導，抑制α-法尼烯合成，降低其氧化產物共軛三烯在果皮中的積累，從而減少虎皮病的發生。

有研究表明，虎皮病的發生也與果實的抗氧化能力有關，而果實的抗氧化能力與抗氧化物質含量和抗氧化酶活性有關[27-28]。α-法尼烯是一種半萜類物質，帶有的共軛雙鍵易自氧化形成H2O2和過氧化產物[29]。CAT、APX和POD是植物體內主要清除H2O2的酶類，其活性的增加可清除多余的H2O2，避免造成細胞膜的膜脂過氧化，從而抑制MDA含量的增加。類黃酮[30-31]、多酚[32-33]、花青苷[34-35]是重要的抗氧化物質，可直接清除活性氧，維持體內活性氧代謝平衡，避免對細胞結構的破壞。本研究結果表明1-MCP顯著提高了貨架后期果皮內花青苷、總黃酮和總酚的含量和DPPH自由基清除能力；同時1-MCP處理還能顯著抑制CAT和APX活力的下降，提高POD活力，減少活性氧的積累，從而減緩果皮膜脂過氧化作用，抑制MDA含量增加，保持果皮細胞結構的完整性，抑制虎皮病的發生。