楊嘯吟,張一敏,梁榮蓉,朱立賢,羅 欣
(山東農業大學食品科學與工程學院,山東 泰安 271018)
肉與肉制品具有較高的營養價值、水分活度(≥0.85)以及適宜的pH值(5.5~6.5),使其極易發生微生物腐敗,這在很大程度上造成了全球每年超過20%的肉品浪費,相當于7 500萬 頭肉牛的產肉量[1]。肉的腐敗變質通常伴隨異味、變色、發黏等現象,其中微生物生長代謝所產生的揮發性有機物(volatile organic compounds,VOCs)是導致肉品腐敗異味的重要來源。
包裝氣體成分和溫度是影響微生物生長的最重要外在因素,不同氣體成分不僅會影響冷卻肉中的菌群演替過程,還會使細菌發生不同類型的代謝活動,從而最終決定了肉品腐敗時所釋放的VOCs種類和含量[2]。包裝肉的腐敗通常是由某些占據種群優勢的特定腐敗菌(specific spoilage organisms,SSOs)引發,這些細菌代謝產生的醇類、醛類、酮類、硫化物、酯類和有機酸是肉品呈現異味的主要VOCs,也是標記肉品貯藏期間氣味變化的重要化學標簽[3]。因此,系統研究不同包裝冷卻肉的腐敗氣味成分,從菌群結構上闡釋其特定VOCs形成的外在原因,并從底物利用和代謝途徑角度分析SSOs產生VOCs的內在原因,對利用特征氣味分子觀測肉品腐敗進程以及抑制肉品腐敗具有指導意義。
鮮切肉中的初始微生物主要源自動物的皮毛、糞便、內臟,以及屠宰加工環境和人為操作的交叉污染,其中不動桿菌、假單胞菌、索絲菌、黃桿菌、嗜冷桿菌、梭狀桿菌、莫拉氏菌、葡萄球菌、微球菌、乳酸菌和腸桿菌是最常見的污染菌,檢測到的初始VOCs主要有己醛、1-辛烯-3-醇、2-丁酮、2,5-辛二酮等[4-5]。
由于透氧托盤包裝內的氣體成分始終與空氣較為相似,在這種低溫有氧環境下,一旦菌落總數超過8(lg(CFU/cm2))就會導致肉品產生異味。乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)、二乙酰(2,3-丁二酮)、2-乙基己醇、3-甲基-1-丁醇、2-丁酮、2-甲基丁酸、乙酸乙酯等是典型的VOCs,這主要歸因于假單胞菌的生長代謝[5-7],這些物質可以作為假單胞菌引發托盤包裝肉品腐敗氣味的關鍵VOCs。常見的假單胞菌菌種有莓實假單胞菌、熒光假單胞菌、隆德假單胞菌和惡臭假單胞菌,莓實假單胞菌和惡臭假單胞菌多為牛肉中的優勢腐敗菌,而豬肉和禽肉中莓實假單胞菌和熒光假單胞菌則更為常見[8-9]。莓實假單胞菌生長過程中會釋放大量甲酯、乙酯(約占總酯類82%)、2-乙基己醇、丁醇、3-甲基-1-丁醇等VOCs,熒光假單胞菌生長過程中會產生戊酮、辛酮、乙偶姻、丁醇等VOCs,隆德假單胞菌生長過程中則會釋放大量1-十一碳烯、5-甲基-2-己酮和甲基-2-丁烯酸等VOCs以及氨氣,而惡臭假單胞菌生長過程中會產生二硫化碳和2-丁酮、辛酮等酮類VOCs[10-13]。另外,熱殺環絲菌也是該包裝下的優勢腐敗菌,伴隨著它們的生長,肉中的2-甲基丙醇、乙偶姻、二乙酰、2,3-丁二醇、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸等VOCs含量會顯著增加,其中兩種甲基丁酸具有酸臭味,是熱殺環絲菌有氧繁殖的特殊代謝產物[3,14-15]。表1為不同包裝冷卻肉中的常見細菌種類。

表1 不同包裝冷卻肉中的常見細菌種類[16]Table 1 Bacterial species commonly found in chilled meat under different packaging conditions[16]
真空包裝促進了厭氧菌和兼性厭氧菌的生長,乳酸菌(彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌、低溫乳桿菌、明串珠菌等)、腸桿菌(液化沙雷菌、水生拉恩氏菌、蜂房哈夫尼菌等)、熱殺環絲菌、梭菌和腐敗希瓦菌是真空包裝牛肉、豬肉、羊肉、禽肉的常見腐敗菌(表1)。在真空包裝牛肉貯藏后期,由于乳酸菌(乳桿菌、乳球菌和肉食桿菌)、梭狀芽胞桿菌(奧吉氏梭菌和腐化梭菌)以及腸桿菌(沙雷氏菌和蜂房哈夫尼菌)的快速增殖,產生了大量CO2以及醇類(丁醇、3-甲基-1-丁醇、2,3-丁二醇等)、醛類(己醛、庚醛、苯甲醛等)等VOCs,進而引起包裝脹袋現象[17]。Mansur等[6]發現丁酸、乙酸和2-丁酮是真空包裝牛肉腐敗進程中的代表性VOCs,它們與低溫乳桿菌的生長密切相關。進一步研究發現戊酸、乙醇、3-甲基-1-丁醇和2,3-丁二醇也可成為真空包裝牛肉腐敗的重要標記物[18]。值得注意的是,丁酸含量與乳酸菌和梭菌數量都呈顯著正相關,而這兩種細菌是導致真空包裝牛肉后期腐敗的優勢菌[6-7,17],因此可把丁酸作為該包裝體系下肉品腐敗的潛在特征VOCs。采用Nisin活性真空包裝則可以有效抑制乳酸菌的生長,在這種包裝環境下肉食桿菌生長所釋放的丁酸、己酸和庚酸這些羧酸類物質是牛肉酸敗氣味的主要來源[19]。不同于透氧袋裝羊肉所檢測到的大量己醛、庚醛和壬醛物質(表2),真空無氧環境促進了乳酸菌的繁殖,其代謝產生的3-甲基丁醛和乙偶姻是真空包裝羊肉腐敗異味的重要VOCs[20-21]。此外,腐敗希瓦菌的生長不僅會產生H2S等惡臭氣味物質,還會造成肉品綠變[22]。
1.3.1 高氧氣調包裝
高氧氣調包裝(體積分數6 0%~8 0% O2配合20%~40% CO2)可賦予紅肉誘人的鮮紅色,是目前最流行的氣調包裝方式。熱殺索絲菌和假單胞菌通常是該包裝冷卻牛肉的SSOs,而且假單胞菌在后期表現出比熱殺環絲菌更好的環境適應性,其中乙偶姻、2,3-丁二醇、辛酸乙酯和己酸這些VOCs與熱殺環絲菌的代謝密切相關[7,28]。但有學者卻發現乳酸菌才是引發高氧氣調包裝牛肉腐敗的主要原因,這在高氧氣調包裝豬肉上也得到了驗證,貯藏前10 d冷生明串珠菌一直是優勢菌種,到第14天肉品腐敗時魚乳球菌則發展為SSOs,此過程中乙醇、乙酸、二乙酰和乙偶姻的含量隨腐敗加劇而快速升高[25,29]。同樣,J??skel?inen等[2]也報道冷生明串珠菌和伴氣明串珠球菌是造成高氧包裝牛肉黃油異味的SSOs,它們生長過程中會伴隨二乙酰、乙偶姻、壬醛、1-辛烯-3-醇和己酸含量的顯著增加。鑒于高氧氣調包裝肉的菌群結構差異是導致出現不同VOCs組成結果的一個重要原因,因此有必要對該包裝下的菌群結構和VOCs變化開展進一步研究,但也發現乙偶姻和己酸是不同菌群產生的共同VOCs,可作為未來預測該包裝牛肉腐敗程度的潛在標記物。

表2 導致不同包裝冷卻肉異味的醇類、醛類、酮類揮發物種類及優勢腐敗菌Table 2 Alcohols, aldehydes, and ketones produced by spoilage bacteria during storage of chilled meat in different packages

續表2
除熱殺索絲菌和乳酸菌外,Nieminen等[23]在高氧氣調包裝豬肉SSOs中分離到了發光桿菌,特別是明亮發光桿菌,該細菌的增殖導致乙偶姻、雙乙酰和3-甲基-1-丁醇這些異味分子的產生。J??skel?inen等[26]則在接種了伴氣明串珠球菌的高氧包裝豬肉中檢測到乙偶姻、雙乙酰、2,3-丁二醇、乙酸、己醛、庚醛的快速產生,這些VOCs賦予豬肉黃油異味。另有學者在高氧氣調包裝雞肉中接種了熒光假單胞菌,發現貯藏10 d內烴類物質最多(17 種)、其他依次為醛類(8 種)、硫化物(6 種)、酯類(6 種)、酮類(4 種)和醇類(3 種),其中戊-1-烯、二甲硫醚、乙偶姻、乙酸乙酯和硫代乙酸甲酯是熒光假單胞菌代謝的主要VOCs[27]。而對接種熱殺環絲菌的高氧氣調包裝雞肉,二乙酰、二甲硫醚、乙偶姻、3-甲基-1-丁醇和乙酸是該包裝體系下的特征VOCs[24]。鑒于同一包裝條件下不同菌種生長過程中會產生相應的揮發性指紋標記物,而揮發物組學方法目前已在肉品摻假鑒定上得到成功應用[30],因此能否借助該技術對包裝肉品中的不同SSOs進行持續監測值得深入研究。
1.3.2 低氧氣調包裝
低氧氣調包裝(O2≤30%(體積分數,下同))可賦予肉品更長的貨架期,其中以O2體積分數不超10%的低氧氣調包裝較為典型,乳酸菌、腸桿菌和熱殺環絲菌是該包裝體系下的優勢腐敗菌[31]。但近期研究結果發現:低氧氣調包裝被認為會限制假單胞菌這種嚴格好氧菌的生長,然而部分韋氏假單胞菌、莓實假單胞菌和隆德假單胞菌在無氧環境中生長良好,且能抵御高體積分數的CO2,其產生的VOCs是無氧氣調包裝牛肉腐敗氣味的重要來源[32]。即便是乳酸菌,也不一定能適應這種低O2高CO2濃度的貯藏環境,Nieminen等[33]指出80% O2有助于豬肉中明串珠菌的生長,無氧環境則促進了乳桿菌的生長,至于CO2較少的無氧包裝則會加劇乳球菌的生長。
一氧化碳氣調包裝(69.6% N2/0.4% CO/30% CO2)是常用的低氧氣調包裝方式,研究發現十二烷、癸醛和乙偶姻是該包裝牛肉中最典型的VOCs[34]。而在40% CO2/30% O2/30% N2包裝牛肉貯藏期間,熱殺環絲菌和乳酸菌是優勢菌群,它們代謝產生的乙酸和2-羥基丙酸加劇了肉品酸敗氣味的產生,且己醇和乙酸乙酯快速增加[5,35]。對于80% CO2/20% N2包裝雞肉而言,氣單胞菌、乳球菌、沙雷菌和希瓦菌則是導致其貯藏后期產生異味的優勢腐敗菌[8]。Tománková等[36]通過比較70% Ar/30% CO2和高氧氣調包裝雞肉的VOCs差異,發現除氨氣和五甲基庚烷這兩種共同VOCs外,二甲硫醚、二甲二硫醚、二甲三硫醚和H2S是Ar包裝雞肉特有的VOCs(表3),這與該包裝下會產生更多的乳酸菌和大腸菌群有關。
不同包裝冷卻肉腐敗散發的VOCs不僅取決于微生物的種類,還在很大程度上取決于微生物代謝所利用的底物種類和含量。碳水化合物是絕大多數細菌生長所需的首要營養物質,一旦肉中的葡萄糖被耗盡,細菌轉而利用肉中或自身代謝產生的乳酸、葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖、丙酮酸、乙醇、乙酸鹽等物質,后續還將分解利用核酸以及蛋白質、脂肪中的氨基酸、脂肪酸和甘油。不同包裝下的優勢菌在此過程中利用的底物不同,因而產生的代謝物也不同,通常有氧氣調包裝肉的腐敗氣味比無氧氣調包裝肉更難聞[37]。葡萄糖是細菌產生3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、乙醇、乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、乙偶姻和二乙酰的前體物質,正是由于糖代謝對乳酸菌生長至關重要,因此在真空包裝肉中才能檢測到比托盤包裝肉更多的醇類和羧酸類物質[3,37];游離氨基酸則是某些酶促脫羧脫氨作用的底物,可生成硫化物、支鏈脂肪酸、甲酯和氨等,而脂肪被細菌酶解后所釋放的揮發性脂肪酸,以及脂肪酸代謝產生的醛類、酮類、酯類等物質同樣是肉品腐敗氣味的重要成分[4]。
不同包裝中細菌對底物的利用順序也不同。假單胞菌在有氧氣調包裝肉中利用的底物依次為葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、乳酸、丙酮酸、葡萄糖酸、葡萄糖酸鹽和氨基酸,而在無氧氣調包裝中則是葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸或葡萄糖酸鹽、乙酸、氨基酸,并不能利用乳酸[22,37]。由于假單胞菌分泌的外源酶擁有更強的蛋白質和脂質水解能力,使得它們能更快地滲入肉品內部獲得更豐富的能量來源,從而在有氧條件下表現出比其他細菌更強的種群優勢和腐敗潛力,此過程會釋放大量的2-壬酮、2-庚酮、乙酸、3-甲基-1-丁醇、2-乙酸辛烯酯[38]。熱殺環絲菌是兼性厭氧菌,在有氧包裝或葡萄糖稀缺的肉中會通過異型發酵依次利用葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、氨基酸、核糖和甘油,乙偶姻就是該菌高氧氣調包裝下進行葡萄糖代謝的終端產物,而典型的2-甲基丁酸和3-甲基丁酸則分別來自其對異亮氨酸和亮氨酸的降解;在無氧或葡萄糖充足環境下,熱殺環絲菌則只能通過同型發酵將葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸轉化為甲酸、乳酸和乙酸這些異味物質[4,22,37,39]。

表3 導致不同包裝冷卻肉異味的硫酸物、酯類、脂肪酸揮發物種類及優勢腐敗菌Table 3 Sulfur compounds, esters, and fatty acids produced by spoilage bacteria during storage of chilled meat in different packages
無論有氧還是無氧包裝,乳酸菌都先利用葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸進行代謝,不同的是,無氧包裝后期乳酸菌還能利用肉中的氨基酸,某些清酒乳桿菌和腸膜明串珠菌就可將組氨酸、酪氨酸、精氨酸、賴氨酸水解成氨氣和組胺、酪胺、精胺、尸胺等生物胺[40]。相較于真空包裝,高氧包裝促進了乳酸菌的異型發酵,生成乳酸、乙酸、CO2,并伴隨著乙醇和乙醛等中間產物的產生,而且一旦葡萄糖耗盡,高濃度的CO2還會促使乳酸菌以乳酸為底物將其氧化為乙酸[2,41-42]。與乳酸菌類似,腸桿菌生長也是先利用葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸,在有氧氣調包裝后期會利用乳酸和氨基酸,而在無氧氣調包裝中則利用乙酸。無氧包裝中,液化沙雷菌和蜂房哈夫尼菌等腸桿菌可將葡萄糖發酵為含有乙酸、甲酸、乳酸、琥珀酸和乙醇的混合物,一旦它們的數量達到6~7(lg(CFU/g)),就會分解氨基酸產生大量硫化物、胺類和支鏈酯類,散發出讓消費者難以接受的氣味,而且這些腸桿菌在高pH值的異質肉中更容易生長[43]。作為造成真空包裝肉品異味的另一大腐敗菌——梭菌(奧吉氏梭菌、腐化梭菌、產氣莢膜梭菌等)則通過代謝葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸來生成乙醇、3-甲基-1-丁醇和丁酸等VOCs,并產生CO2和H2導致包裝膨脹[17,44]。
細菌為應對特定包裝環境所開展的代謝方式并不相同,這將最終影響肉的腐敗進程。例如氣調包裝會誘發乳酸菌異型發酵,通過磷酸戊糖途徑釋放乙醇和乙醛等異味VOCs,而牛至精油則能激發乳酸菌同型發酵,通過糖酵解生成乳酸[3,41]。從代謝類型轉換角度來看,向氣調包裝肉中添加牛至精油將有利于抑制包裝肉品的異味產生,因此了解不同包裝微生物合成VOCs的代謝途徑十分必要。
醇類的產生涉及氨基酸降解以及酮類、醛類的還原等多個代謝通路,因此,在不同包裝肉中都能檢測到此類物質,其中比較有代表性的是2,3-丁二醇、3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、丁醇、己醇和1-辛烯-3-醇(表2),假單胞菌、熱殺環絲菌和肉食桿菌被認為是肉中醇類物質的主要合成者[4,45]。在高氧氣調包裝中,2,3-丁二醇可由廣布肉食桿菌和熱殺環絲菌通過丙酮酸代謝途徑還原乙偶姻合成(圖1),而3-甲基-1-丁醇也是熱殺環絲菌的有氧代謝產物,可由其水解氨基酸產生[24]。

圖1 細菌的丙酮酸代謝途徑及相關揮發性代謝產物Fig.1 Bacterial pyruvate metabolism pathways associated with volatile metabolites
醛類的產生主要源于三酸甘油酯的水解、不飽和脂肪酸β-氧化或脂質的自動氧化,以及氨基酸轉氨作用等途徑,因此,醛類(尤其是短鏈醛類物質)通常具有脂肪酸敗的氣味,假單胞菌、熱殺環絲菌、肉食桿菌和腸桿菌是肉中醛類物質的主要貢獻者[4,46]。己醛、壬醛、庚醛、苯甲醛和3-甲基丁醛是最常見的醛類,在不同包裝肉中都有檢出(表2)。作為衡量包裝牛肉貨架期的重要指標,己醛、壬醛等醛類物質可通過亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化代謝產生[2,34]。甲基丁醛則是乳酸菌利用支鏈脂肪酸(如亮氨酸)生成3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇或2-甲基丙烷的中間產物[47]。
酮類可以來自脂肪酸的自動氧化以及酶促α-或β-氧化,也可以通過革蘭氏陰性菌水解脂質、降解烷烴以及對醇類脫氫完成,酮類物質在以假單胞菌、熱殺環絲菌、乳酸菌、腸桿菌為主的包裝肉中都能檢出,其中乙偶姻和二乙酰是不同包裝肉腐敗所產生的最重要酮類物質[5]。在細菌的酶促丙酮酸代謝通路中,丙酮酸先被轉化為乙酰乳酸,經進一步氧化后生成二乙酰,而二乙酰則可被二乙酰還原酶還原為乙偶姻[39](圖1)。
無論是在有氧還是無氧包裝肉中,微生物(假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌等)降解含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)都會釋放硫化物,甲硫氨酸代謝是這些細菌產生二甲硫醚、二甲二硫醚和二甲三硫醚等常見硫化物的主要途徑:甲硫氨酸先被分解為甲硫醇,再經氧化后成為具有惡臭味的高分子硫化物[22]。
乙酸乙酯、硫代乙酸甲酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯是包裝肉中比較常見的揮發性酯類,賦予了腐敗肉水果異味,其中莓實假單胞菌、熒光假單胞菌和熱殺環絲菌被發現是有氧氣調包裝肉中酯類物質的重要制造者(表3)。這些酯類一方面來自細菌自身合成醇類和羧酸類物質的酯化作用;另一方面也可通過醇類與攝入脂肪酸的酯化合成[48]。
導致肉品酸敗異味的VOCs多為一些揮發性脂肪酸,它們可通過微生物碳水化合物代謝(氧化酮、醛、酯類)或水解脂質和氨基酸等途徑生成[49]。乙酸、丁酸和己酸這些直鏈脂肪酸在不同包裝肉中都有發現,而甲基丁酸這類支鏈脂肪酸則只在有氧包裝肉中才被發現。乙酸是乳酸菌異型發酵的重要代謝產物,而在真空包裝肉中,梭菌則會分別利用葡萄糖或氨基酸為底物進行丁酸發酵或Stickland反應并最終生成丁酸[50]。此外,肉食桿菌和熱殺環絲菌的代謝也會釋放大量揮發性脂肪酸(表3)。
氣相或液相色譜串聯質譜法是目前最常規的VOCs檢測手段,以頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法最為常用,學者們用該技術對不同包裝貯藏牛肉、豬肉、羊肉、禽肉的VOCs進行了大量研究[8,21,29,35]。傳統色譜-質譜法檢測樣品需要長時間的前處理,這導致VOCs的測定被間隔化,所提供信息不能及時反映樣品的原有狀態。針對上述弊端,質子轉移反應質譜技術應運而生,可實現肉品VOCs的實時監測,但此方法仍存在同分異構體分子難以區分的局限性,未來氣相色譜技術如果能與質子轉移反應飛行時間質譜技術相結合將能有效解決此問題[24]。
電子鼻利用傳感器可將氣味分子的化學信號轉化為電信號,從而通過模擬人的嗅覺來描述食物的復雜氣味,該技術能夠依據樣品的整體氣味對肉品腐敗程度進行高效精確評估,而且還能區分不同貯藏條件下不同物種肉的氣味特征,具有很好的實用價值。但是當前的電子鼻技術還存在傳感器壽命短、不能精確定性定量分析特征VOCs等缺點,這都很大程度上制約了其大規模推廣[51]。未來電子鼻結合生物傳感器實現VOCs的精確識別將是該技術的一大發展方向。
基于光譜識別的微生物代謝物無損快檢技術是食品科學領域的前沿熱點,以傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜和高光譜成像技術為主流。高通量傅里葉變換紅外光譜具有靈敏度、精度、分辨率高和波段寬等特點,Kosa等[52]采用該技術成功檢測到產油真菌中的生物聚合物、多糖、脂肪酸等代謝物。拉曼光譜受水分子影響較小,因此更適合分析復雜環境下的細菌代謝物,Morelli等[53]就利用表面增強拉曼散射方法精確定量了大腸桿菌分泌的香豆酸和肉桂酸。高光譜成像技術目前已被用于監測藻類代謝物的變化積累,而該技術對腐敗菌VOCs的鑒定則還有待深入研究[54]。
不同包裝環境會改變肉的菌群結構,并激發SSOs啟動相應的代謝通路,促使肉品腐敗時釋放出具有迥異氣味的VOCs,而且不同包裝優勢菌的底物利用與代謝類型也會直接影響肉品VOCs的組成和含量,這能夠最終決定肉品的腐敗程度。因此,掌握特定包裝肉中不同腐敗菌的演替過程及其潛在VOCs標記物的種類和合成機制意義重大,將有利于采取靶向措施調控和監測肉品微生物腐敗進程。
為抑制肉品腐敗氣味的產生,未來可基于不同包裝SSOs的生長特性開發新型活性包裝:通過緩釋特定的天然植物提取物來改善菌群結構,并調節肉中SSOs的代謝途徑,使其朝可產生更弱異味VOCs的方向發展。鑒于微生物脫羧生化反應是其生成異味VOCs的重要途徑,而CO2作為該代謝過程的重要產物會抑制脫羧反應的進行[55],因此,通過開發具有CO2緩釋功能的活性包裝來抑制肉品異味也將成為可能。另外,隨著食物組學技術的快速發展,可將基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等手段與揮發物組學進行有機結合,從而高通量精確識別不同包裝肉的特征腐敗氣味分子,探尋出更多能夠標記肉品腐敗的指紋揮發物,并在此基礎上利用大數據、生物電子傳感器等新興技術綜合開發可用于預測肉品貨架期的智能包裝系統,最終實現對冷卻肉全鏈條流通的實時監控。