水中產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢測

余沛芝，劉玉紅，章文華，何 敏，許小燕，徐小燕，周 婷

(蘇州工業園區清源華衍水務有限公司水質中心，江蘇蘇州 215021)

產氣莢膜梭狀芽孢桿菌，屬于芽孢桿菌科梭狀芽孢菌屬，在自然界中廣泛分布，其芽孢是一種能夠引起人類食物中毒和動物壞死性腸炎的食源性病原[1-3]。微生物污染是飲用水安全的一大威脅。因此，監測水中產氣莢膜梭狀芽孢桿菌，對評價水資源污染狀況和評估自來水廠的水處理能力，均具有重要意義。

在《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)附錄A[4]中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌為水質參考指標，且限值為0 CFU/(100 mL)，但未指定相應的檢測方法。因此，對目前現行有效的3個檢測標準(GB 4789.13—2012、GB/T 8538—2016和SN/T 0177—2011)[5-7]進行匯總對比。

參考這幾個標準中所用到的分離培養基(胰胨-亞硫酸銨-環絲氨酸瓊脂培養基，TSC)和增菌培養基(液體硫乙醇酸鹽培養基，FTG)，借鑒文獻中[8]提及的復蘇培養基(皰肉培養基)，對購買的產氣莢膜梭菌菌種同時進行復蘇培養，考察該菌在這幾種不同培養基中的生長情況。通過對不同培養基復蘇后的同代培養產物，開展不同的性能確證試驗，進一步驗證其性能復蘇狀況，并記錄下各自陽性反應的特征圖片，作為樣品檢測的陽性對照。

傳統檢測方法存在檢測步驟多、所需培養基種類多、檢測耗時長、假陽性檢出率高等缺點。因此，使用顯色培養基，對南方某自來水公司雙水廠的出廠水、水源水和某污水處理廠的進水、二沉池出水中的產氣莢膜梭菌含量分別進行檢測，發現與使用傳統檢測方法的結果一致，但使用顯色培養基可明顯簡化檢測流程和縮短檢測時間。

1 材料和方法

1.1 試驗設備和耗材

生物安全柜(蘇凈安泰)；恒溫培養箱(上海精宏)；厭氧培養罐(日本三菱)；移液槍(BRAND)；生物顯微鏡(上海光學)；高壓蒸汽滅菌器(雅馬拓)；3聯抽濾裝置(默克)；0.45 μm微生物濾膜(密理博)；純水機(密理博)；一次性接種環(RENON LAB INOCULATION LOOP)、一次性無菌吸管(FOOBON TUBES)、一次性無菌培養皿(NEST)。

1.2 菌種、培養基和試劑

產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CICC22949)來自中國工業微生物菌種保藏管理中心；皰肉培養基、皰肉牛肉粒、無菌液體石蠟、胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基(TSC培養基)及配套P-15B D-環絲氨酸、乳糖亞硫酸鹽培養基、液體硫乙醇酸鹽培養基(FTG培養基)、含鐵牛乳培養基、乳糖-明膠培養基、革蘭氏染色液，均來自北京路橋技術有限責任公司；還原鐵粉(福晨化學)；緩沖動力-硝酸鹽培養基(海博生物)；法國科瑪嘉顯色培養基(上海欣中)；磷酸鹽緩沖溶液無菌稀釋水(HARDY DIAGNOSTICS)；甲、乙試劑(廣東環凱)；厭氧產氣袋、厭氧指示劑(日本三菱)。

1.3 菌種復蘇和性能驗證

將購買的菌種凍干粉，用500 μL市售磷酸鹽緩沖溶液無菌稀釋水充分溶解后，用一次性接種環分別接種至皰肉培養基、FTG液體培養基，劃線至TSC培養基平皿(劃線后，需再覆蓋1層TSC瓊脂[8])，置于厭氧培養罐中，36 ℃培養24 h。取培養好的菌液，再接種至新的皰肉培養基、FTG液體培養基和劃線至TSC培養基平皿，于36 ℃厭氧培養24 h。重復該步驟，得到第三代培養物。

參考文獻[9]中指出，菌種復蘇傳代的第二、三、四代培養物均可開展相應的純度和生化鑒定，本文選用不同培養基復蘇后的第三代培養物，開展不同的性能確證試驗。包括：(1)革蘭氏染色，觀察顯微鏡下的菌落形態；(2)取1 mL培養物接種于含鐵牛乳培養基，以厭氧和有氧2種方式，置于46 ℃培養箱中培養5 h；(3)用接種針沾取培養物，接種至硝酸鹽培養基，置于36 ℃培養箱中厭氧培養24 h；(4)用接種針沾取培養物，接種至乳糖-明膠培養基，置于36 ℃培養箱中厭氧培養24 h后，再將其置于4 ℃冰箱中冷藏1 h；(5)用無菌滴管取5滴培養物，接種至乳糖-亞硫酸鹽(LS)液體培養基，置于46 ℃培養箱中厭氧培養24 h。

1.4 樣品的檢測

取南方某水司雙水廠的出廠水和水源水各100 mL，用抽濾裝置抽濾后，將濾膜緊貼置于TSC瓊脂和顯色培養基上，并用TSC瓊脂和顯色培養基對濾膜再次進行澆筑，形成厭氧環境。取南方某污水處理廠進水和二沉池出水各1 mL(進水稀釋1 000倍)，分別用TSC瓊脂和顯色培養基進行澆筑，待凝固后，再分別覆蓋TSC瓊脂和顯色培養基。對TSC瓊脂中出現的黑色特征菌落，選取5個(不足5個時，全部選取)分別接種于FTG培養基中，厭氧培養24 h后，取每根FTG中的培養物5滴再次接種于LS培養基中，有氧培養24 h后，觀察是否有黑色沉淀及導管中是否有大于1/4的氣體，有則說明是陽性，否則為陰性。

2 結果和討論

2.1 3種現行有效標準匯總對比

從檢測范圍、取樣方式、初培養方式、分離培養基、增菌培養基、性能確證試驗種類、結果匯總等方面，對現行有效的3個標準進行匯總對比，如表1所示。

表1 3個現行有效標準的匯總對比Tab.1 Summary and Comparison of Three Existing Effective Standards

由表1可知，這3個標準均采用傳統的培養-增菌-性能驗證-結果計數的檢測模式：均需對待檢樣品初培養后的黑色特征菌落進行增菌培養；再對增菌后的菌液開展不同的性能驗證試驗，或使用全自動微生物鑒定系統進行性能確證；最后根據初培養的特征菌落數，結合性能驗證試驗結果，給出最終的檢測結果。

2.2 菌種復蘇和性能驗證

2.2.1 菌種復蘇

在目前現行有效的3個標準中，分離培養基有亞硫酸銨-環絲氨酸瓊脂培養基和亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂培養基。文獻[10]指出，在檢測產氣莢膜梭菌時，這2種培養基通過試驗對比，發現TSC瓊脂檢測結果的標準差最小，數據最為穩定。同時，3種不同的標準均在檢出特征菌落后，使用FTG培養基對特征菌落進行增菌培養，也有文獻[8]使用皰肉培養基對產氣莢膜梭菌的菌種凍干粉進行復蘇培養。因此，選用TSC瓊脂、FTG培養基和皰肉培養基，分別對凍干粉菌種進行復蘇培養，考察菌種在這3種不同培養基中的生長情況。結果如表2和圖1所示，產氣莢膜梭菌的菌種在這3種培養基中，均生長良好。

表2 產氣莢膜梭菌在不同培養基中的生長情況Tab.2 Growth of Clostridium perfringens in Different Media

圖1 TSC培養基、FTG培養基、皰肉培養基培養物圖片Fig.1 Cultures Resuscitated from TSC Medium, FTG Medium and Cooked Meat Medium

2.2.2 傳代產物的性能驗證試驗

選用不同培養基的同代培養物開展性能確證試驗，進一步考察不同培養基的性能復蘇情況，同時也可作為樣品檢測的陽性對照。

其中：(1)革蘭氏染色試驗，結果均顯示為革蘭氏陽性桿粗短桿狀菌，有明顯莢膜，有的可見芽孢，呈卵圓形，位于菌體末端；(2)牛奶發酵試驗，在5 h內均出現劇烈發酵現象，且培養基不變黑；(3)動力-硝酸鹽確證試驗，接種培養物在培養基中均無穿刺生長現象，往其中分別滴加甲、乙試劑后，均瞬間變為明顯的深紅色液體；(4)乳糖明膠確證試驗，厭氧培養24 h后培養基均變黃，且瓶底有沉淀，說明乳糖被發酵，將其置于4 ℃冰箱中冷藏1 h后，也均呈液體；(5)乳糖-亞硫酸鹽確證試驗，各試管底部均出現黑色沉淀，且導管中均充滿大于1/4的氣體。以上5項性能驗證試驗結果，均與目前現行有效的3種標準中，所列出的陽性現象一致。部分性能確證試驗結果如表3所示。

表3 不同培養基傳代產物開展性能確證試驗結果匯總Tab.3 Summary of Experimental Results on Different Properties of Subcultured Products in Different Media

2.3 樣品的檢測

取南方某水司雙水廠的出廠水和水源水樣品均100 mL，0.45 μm濾膜過濾后，用無菌鑷子將濾膜置于提前澆注好的TSC瓊脂和顯色培養基平板上；取南方某污水處理廠進水和二沉池出水(稀釋1 000倍)樣品1 mL，用平板澆注的方法，分別用TSC瓊脂和顯色培養基澆注平板，待瓊脂凝固后，均分別覆蓋1層TSC瓊脂和顯色培養基。培養結果如表4和圖2所示。

表4 用TSC瓊脂和顯色培養基培養的檢測結果Tab.4 TSC and Chromogenic Medium Plate Test Results of Tap Water, Source Water and Effluent Water

圖2 水源水2和污水二沉池出水用TSC瓊脂和顯色培養基培養結果圖Fig.2 Culture Results of Source Water 2 and Effluent from Secondary Sedimentation Tank of Sewage Plant with TSC Agar and Chromogenic Medium

由表4可知，2個水廠的出廠水，無論是用TSC瓊脂澆注，還是用顯色培養基，均無特征菌落，符合《生活飲用水衛生標準》的要求。水源水1和水源水2的濾膜，用TSC瓊脂培養分別檢出3個和32個黑色特征菌落，而用顯色培養基培養均未出現橙色特征菌落。對TSC瓊脂中的這3個和32個黑色特征中的3個和5個特征菌落，分別進行FTG培養和LS確證試驗，試驗結果均未出現陽性反應特征，說明這些黑色的特征菌落均不是產氣莢膜梭菌，與顯色培養基結果一致。

污水廠進水稀釋1 000倍后，在TSC平板中有18個黑色特征菌落，顯色培養基中有17個橙色特征菌落。對18個黑色特征菌落中的5個進行增菌和性能驗證，結果均為陽性，即這18個黑色特征菌落均為產氣莢膜梭菌，這和顯色培養基的結果非常接近。污水廠二沉池出水的TSC瓊脂平板中有28個黑色特征菌落，顯色培養基中有21個橙色特征菌落。通過對28個黑色特征菌落中的5個進行增菌和性能驗證后，顯示其中1個菌落為陰性，根據標準中的計算方法[7]，得出該1 mL樣品中的產氣莢膜梭菌數量為22個，這和顯色培養基得出的21個橙色菌落也非常接近。

3 結論

(1)《生活飲用水衛生標準》中關于產氣莢膜梭菌的限量要求是0 CFU/(100 mL)，如果參考GB 4789.13—2012和SN/T 0177—2011的取樣方式，選用1 mL樣品的檢測量，很有可能造成漏檢的風險。因此，建議出廠水取樣量為100 mL，以保證最大檢出率，可參考GB/T 8538—2008的膜過濾培養方式進行檢測。水源水或污染嚴重的樣品，視情況決定是否稀釋，如果稀釋倍數達到或超過100倍，可直接取1 mL樣品，選用平板澆注法進行檢測。

(2)TSC培養基、FTG培養基和皰肉培養基，均可使產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌種復蘇和性能恢復。由于皰肉培養基配制復雜，且在3個標準中，均未涉及，推薦使用FTG培養基或者TSC培養基，以此來簡化試驗操作流程和實驗室的培養基儲備種類。

(3)含鐵牛乳確證試驗在有氧和厭氧條件下培養，均可出現劇烈發酵現象，因此，厭氧裝置不夠時，可直接有氧培養。但需注意，不可將1 mL培養液直接接種至含鐵牛乳培養基表面，而應接種至含鐵牛乳培養基內部。可通過攪拌等方式，使培養物與含鐵牛乳培養基充分接觸，否則就算是陽性培養物，也不會出現劇烈發酵的現象。這可能是由于培養物被含鐵牛乳培養基充分包裹，間接形成了厭氧環境，當有氧培養時，也會出現陽性反應特征。

(4)本文通過對實際樣品的檢測，發現顯色培養基和傳統培養方法對陽性樣品的檢測結果非常接近。使用顯色培養基可明顯簡化檢測流程、縮短檢測時間。表5對傳統檢測方法和顯色培養基檢測法的部分差別進行了匯總。

由表5可知，顯色培養基在縮短檢測時間和降低培養基種類方面，均優于傳統檢測方法。厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌，經過TSC或SPS培養基厭氧培養后，均可生成黑色特征菌落[11]。因此，需對黑色菌落開展諸多性能驗證試驗，確認是否為產氣莢膜梭菌。傳統的檢測方法，1個稀釋度的樣品可能需對5個特征菌落進行培養和驗證；污染較嚴重的樣品，涉及到幾個稀釋度時，可能需對多個稀釋度的各5個特征菌落進行增加和性能驗證，檢測量非常大。當待檢樣品多、樣品污染較嚴重，需稀釋時，更推薦使用產氣莢膜梭菌的顯色培養基來縮短檢測時間和步驟。