骨化三醇對糖尿病腎病大鼠尿液Smad1 水平的影響

蘭 凱，張光偉，劉樹義，張旭東，田 甜

（西安醫學院臨床醫學院，陜西 西安 710021）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥之一，近年來我國糖尿病發病率不斷增長。糖尿病腎病初期癥狀不明顯，容易造成漏診，一旦發展到終末期腎病就必須依靠腎臟替代治療來維持，因此早期診斷及治療成為學者關注的焦點。有研究顯示[1]，骨化三醇具有減輕糖尿病腎病大鼠蛋白尿及腎臟保護作用，但具體影響機制尚不清楚，可能與減輕腎小球系膜基質增生有關，目前這方面的研究較少。近年來研究發現在腎臟疾病發生發展過程中Smad1 蛋白發揮信號傳導作用，被認為是糖尿病腎病腎損傷的標志物，其可直接調節腎小球基底膜Ⅳ型膠原等關鍵纖維化因子的轉錄活性，從而可能影響到蛋白尿的發生[2，3]。本研究擬通過骨化三醇對糖尿病腎病大鼠尿液信號蛋白Smad1 水平的影響及尿蛋白改變情況，探討該藥物對腎臟保護作用的可能機制，為糖尿病腎病的診治提供新的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 購入清潔級封閉群雄性SD大鼠30 只，體質量（200±20）g，均普通飲食喂養。采用隨機數字表法將其分為骨化三醇組（T 組）、DN組（D 組）和對照組（N 組），每組10 只。大鼠進行糖尿病腎病造模，剩余10 只大鼠為健康對照組（N組）。本研究嚴格按照我國實驗動物倫理的要求進行，所有動物實驗均按照西安醫學院倫理委員會的指導方針進行，并經西安醫學院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構建 T 組和D 組大鼠禁食10 h后，予鏈脲菌素（美國Sigma 公司）單次無菌經腹腔注射，60 mg/kg，健康對照組給予腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，常規飲食喂養，檢測血糖。72 h 后T組和D 組分別取大鼠尾靜脈血檢測空腹血糖（FBG），FBG≥16.65 mmol/L 確定糖尿病大鼠造模成功，正常飲食喂養3 周后留尿檢測24h 尿蛋白量≥30 mg 確定為糖尿病腎病大鼠。T 組將骨化三醇（上海羅氏制藥公司，規格0.25 μg/粒，批號J20190056）溶于花生油，以0.03 μg/（kg·d）的劑量進行灌胃治療；D 組和N 組均給予等量的花生油灌胃。

1.2.2 血、尿指標檢測 12 周后所有大鼠代謝籠收集24 h 尿液，記錄24h 尿量和飲水量，進食8～10h 后稱重，用10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，腹主動脈采血4～5 ml，立即送檢。24h 尿蛋白采用雙縮脲法檢測，依照試劑盒（美國R&D 公司試劑盒）操作流程，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 測定大鼠尿液Smad1 蛋白水平；自動生化儀（美國Glamour 生化儀）檢測空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血鈣、血磷和甲狀旁腺激素（PTH）。

1.3 觀察指標 比較治療12 周后各組24h 尿蛋白含量、尿Smad1 蛋白水平、血肌酐、血鈣、血鱗、空腹血糖及PTH。分析尿液Smad1 水平和24h 尿蛋白量相關性。

1.4 統計學處理 所有數據采用SPSS 19.0 軟件包進行統計學分析。計量資料數據采用（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSDt檢驗。兩變量之間相關性描述采用直線相關性分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療12 周后各組大鼠血指標比較 T、D 組空腹血糖、肌酐和PTH 均高于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；T 組肌酐低于D 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；T 組血鈣、血磷與N 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 治療12 周后各組大鼠血指標比較（）

表1 治療12 周后各組大鼠血指標比較（）

注：與N 組比較，aP＜0.05；與P 組比較，bP＜0.05

2.2 治療12 周后各組大鼠尿液Smad1 水平和24h尿蛋白量變化情況 T 組和D 組尿液中的Smad1 水平及24h 尿蛋白高于N 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；T 組尿液中Smad1 水平及24h 尿蛋白低于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 治療12 周后各組大鼠尿液smadl 水平和24 h 尿蛋白量變化比較（）

表2 治療12 周后各組大鼠尿液smadl 水平和24 h 尿蛋白量變化比較（）

注：與N 組相比，aP＜0.05；與P 組相比，bP＜0.05

2.3 尿液Smad1 水平和24 h 尿蛋白量相關性 糖尿病腎病大鼠尿液中Smad1 蛋白水平和24h 尿蛋白量呈正相關（r=0.671，P＜0.05）。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病病人最為常見的慢性微血管特異性并發癥，糖尿病腎病發病率呈逐年上升的趨勢，已成為導致臨床終末期腎病的主要病因之一[4，5]。由于該病患者機體存在復雜的代謝紊亂，往往要比其它腎臟疾病治療起來更加棘手。研究發現糖尿病腎病發病包括糖的高代謝異常、腎組織氧化應激及腎臟血流動力學改變等因素，均可引起腎小球濾過膜的損傷，最終導致患者蛋白尿的發生，而微量蛋白尿被廣泛認為就是糖尿病腎病的早期標志[6，7]。臨床上患者出現持續性蛋白尿說明腎臟可能已經發生的實質性損害。蛋白尿目前已被證實是腎臟損傷的獨立危險因素，有效控制蛋白尿可以延緩糖尿病腎病腎臟功能減退，是目前研究治療的一個突破口。

近來多項研究發現維生素D 具有除調節體內鈣磷代謝以外更廣泛的生理作用，其還可能影響免疫、生殖、內分泌、神經等生理活動的調節。活性維生素D 是一種脂溶性維生素，其通過影響細胞內介導特異維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）發揮生物學活性[8，9]。維生素D 類似物的分子結構同活性維生素D 相似，可以和VDR 結合通過結構修飾改變產生生物學效應，具有與活性維生素D相似的生物學活性，目前主要包括骨化三醇、帕立骨化醇和度骨化醇等[10，11]。骨化三醇作為維生素D類似物中臨床應用最為廣泛的一種，前期的研究主要集中在其調節鈣磷代謝及治療佝僂病等方面的作用，近年來有關骨化三醇可能參與腎臟保護作用的研究越來越多。

本研究發現在骨化三醇治療12 周后糖尿病腎病大鼠蛋白尿指標較未治療組明顯下降，肌酐水平也有下降，尿液中的Smad1 蛋白水平較未治療組有所下降，證實了其具有獨立于鈣磷代謝以外的腎臟保護作用，推測骨化三醇可能具有影響信號蛋白Smad1 的作用。Smad 蛋白家族被證實是一類細胞內的信號傳導蛋白，其可將TGF-β 信號通路信息從受體傳導至靶向細胞內核中，并可在多種靶向細胞種類中發揮重要作用，如調節細胞的分化凋亡，合成基質等，同時也參與免疫調節和組織修復[12，13]。有研究發現，Smad1 蛋白作為Smad 蛋白家族一員是TGF-β1下游重要的信號傳導因子，在糖尿病腎病整個病程的進展中發揮著重要的調節作用，可促進足細胞線粒體NADPH 氧化酶增多，抑制了線粒體的功能，誘導腎小球的肥大、形狀的改變，甚至細胞凋亡，最終可引起腎小球硬化，造成腎臟功能的持續惡化，導致患者進入終末期腎病[14-16]。研究發現骨化三醇不僅具有調節鈣磷代謝的生物學作用，還可能通過影響炎癥因子分泌、改善系膜細胞增殖、抑制RAS 系統、減少細胞外基質沉積等途徑改善糖尿病腎病病理生理過程，具有獨立于鈣磷代謝以外的腎臟保護作用[17-19]，但其具體作用機制尚不完全清楚。有研究表明[20,21]，骨化三醇可能通過調節細胞內核因子κB 通路，影響其下游的炎癥因子表達減少，抑制炎癥反應，進而緩解腎臟組織炎癥損傷及腎小球纖維化的進展，從而對改善腎臟功能起到一定的保護作用，與上述研究結果是一致的。同時本研究發現糖尿病腎病大鼠尿液中Smad1 信號蛋白水平和24 h 尿蛋白量成存在正相關趨勢，這也說明了Smad1 信號蛋白可以影響糖尿病腎病蛋白尿的發生及進展，其能否作為糖尿病腎病診斷檢測的指標還需要進一步的研究。

綜上所述，骨化三醇可以調節信號蛋白Smad1水平，從而改善糖尿病腎病大鼠蛋白尿的，改善腎臟功能，延緩糖尿病腎病的發展，給臨床上糖尿病腎病的診斷治療提供了新思路。