活性氧對胚胎發育的影響

李曉娜，張振剛，馬學工，李斌業

（青海省人民醫院生殖中心，青海 西寧 810007）

不孕不育癥已日漸成為影響健康的普遍性問題，且發達國家及發展中國家不孕不育癥患病率均持續上升，其與性傳播疾病增加、肥胖、婚育年齡延遲等因素密切相關。輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）日漸成熟，現已成為治療不孕不育的主要方法。影響體外胚胎質量的因素如遺傳因素、胚胎環境（pH、滲透壓、溫度以及氣體組成等）、卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）等，可能導致胚胎細胞核與細胞質發育不平衡，最終影響胚胎質量、移植率以及妊娠率等[1-3]。活性氧（reactive oxygen species,ROS）是細胞代謝的正常產物，但是過度的ROS 則會對細胞產生損傷，如DNA損傷、線粒體功能障礙、脂質過氧化的蛋白質氧化修飾等，從而使卵母細胞細胞惡化，最終影響其正常發育[4，5]。卵母細胞在生長過程中會產生ROS，而體外培養的過程中會有很多人為因素的干預，如燈光、機械處理、空氣等都會產生額外的ROS。研究發現[4]，與體內成熟卵母細胞相比，體外培養卵母細胞更容易受到氧化應激反應的影響。此外，姜薇等[6]研究表明，抗氧化劑可以與氧自由基結合，可抑制自由基鏈的起始增殖，減輕氧化應激損傷，消除ROS 對胚胎造成的影響，進而提高體外培養中卵母細胞的質量。本文就ROS 對胚胎的影響機制及減輕ROS 對胚胎損傷的方法作一綜述，以期為提高臨床妊娠率提供相關的理論依據。

1 ROS 對胚胎的影響機制

機體在正常生理條件下氧化防御系統處于平衡狀態，當機體抗氧化系統不能有效地中和組織和細胞所產生的氧化物時就會產生所謂的氧化應激[7]。研究表明[8]，氧化應激是導致女性不孕不育的重要影響因素，在卵泡生長發育過程中，氧化應激可誘導卵母細胞發生變形甚至凋亡，改變減數分裂紡錘體，引起脂質過氧化、細胞膜的選擇性消失，胞質酶失去活性和DNA 損傷。ROS 是一種通過線粒體電子鏈中有氧代謝產生的氧自由基，它是細胞信號轉導、受體激活以及基因表達等機制的重要參與者，適量的ROS 可以維持卵母細胞的正常生理狀態，而過量的ROS 會產生氧的毒性代謝離子，如過氧根離子（O2-）和氫氧根離子（OH-），使得卵母細胞膜發生組成發生改變，膜的不穩定性和卵母細胞卵裂異常，引起胚胎發育中正常所需物質發生變化，最終使得胚胎發育停滯甚至死亡[9，10]。ROS 通過不同的信號通路對胚胎發育產生不同的影響，具體機制如下。

1.1 ROS 通過調控p53 因子影響胚胎發育 隨著胚胎冷凍技術的不斷發展，越來越多的生殖中心會選擇冷凍胚胎來找尋患者的最佳移植時期。研究發現[11]，在凍融胚胎過程中，胚胎對ROS 會產生更高的敏感性，而過氧化氫（H2O2）作為ROS 的重要組成部分，與P53 有著很大的聯系。

p53 一直作為“基因衛士”被臨床知曉，其是細胞周期和細胞凋亡的調控者。機體在一定條件下p53 才會被激活，如機體滲透壓發生改變、氧化應激狀態以及紫外線照射等。研究發現[12]，在敲除p53 的小鼠模型中，其卵母細胞會出現分裂異常和受精率降低等現象，它可以在胚胎的配子發生有絲分裂時保護遺傳的穩定性。井洋洋等[13]研究發現，經過H2O2處理后，胚胎中的p53 基因mRNA 表達量明顯高于對照組；GADD45 作為p53 基因大的下游基因，同樣經過H2O2干預后，其表達量也明顯高于對照組；當添加了抗氧化劑時，結果發現p53 表達量有明顯的下降，且伴隨著ROS 表達量減少，p53 基因mRNA含量也會出現下降，說明ROS 引起的氧化應激可能會通過影響p53 表達量對胚胎發育進行調控，由此可以進一步推測在胚胎處于氧化應激狀態時。同時，p53 也可以通過調控GADD45 等下游基因來修復細胞損傷，保證胚胎染色體穩定性，最終確保胚胎的遺傳完整性。此外，當胚胎處于應激狀態時，會產生較多的ROS，它能夠激活p53 基因，該基因可以通過調控其上游或下游基因的表達量，以此對胚胎細胞周期產生影響[14，15]。

1.2 ROS 通過干預細胞自噬影響胚胎發育 自噬是指從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以此實現細胞內物質的再循環[16]。機體在生理或病理情況下，自噬大都會產生作用，其中卵母細胞在生長發育的過程中會產生大量的蛋白質和mRNA，在蛋白質降解過程中，自噬起著尤為重要的作用[17]。研究發現[18]，存在自噬缺陷的胚胎發育不會超過8 細胞，其機制可能是胚胎從4 細胞到8 細胞過程中會進行大量的蛋白質合成，而自噬缺陷的胚胎新和成蛋白的能力就會受到抑制，從而影響胚胎的正常發育。

此外，胚胎在發育的過程中會產生大量的ROS，并且有研究發現[19]，伴隨著ROS 表達的增多，自噬標志物LC3-Ⅱ的含量也會升高，說明ROS 與自噬之間存在重要的聯系，并且能夠誘導自噬的產生，其機制主要有以下幾方面：①ROS 可以通過促進細胞核內的染色質相關蛋白HMGB1 向細胞質轉運，進而上調細胞自噬水平；②ROS 可以通過激活ClassⅢPI3K/Beclin1 信號通路，抑制mTOR 和Akt信號通路中的相關蛋白的表達量，從而誘導自噬產生；③p53 靶基因編碼的蛋白能夠誘導凋亡調控因子（TIGAR）間接的減少ROS 的表達量，從而阻礙自噬的發生。由此可以推測，ROS 可以通過多條信號通路對自噬產生影響，但ROS 究竟是如何通過自噬作用對胚胎細胞產生影響還需要更加深入的研究。

1.3 ROS 與胚胎細胞凋亡的關系 細胞凋亡是一種不可避免的生理現象。細胞在發育過程中會發生代謝反應，使得衰老的線粒體過度堆積，隨之產生過多的ROS，進而使得氧化應激不斷增強，相反的就會損傷細胞線粒體和溶酶體等，激活凋亡途徑，最終導致細胞的凋亡[20]。許鵬宇等[21]通過對第3 天廢棄胚胎研究發現，人類胚胎的碎片率與ROS 表達量呈正相關性，此外，將胚胎分別置于5%和20%氧氣環境下培養后發現，20%氧氣環境下ROS 的表達量明顯高于5%氧含量環境，由此推測高水平的ROS 可能會造成胚胎造成損傷，阻礙胚胎正常發育[22]。胚胎是由精子和卵母細胞融合而成，精子與卵子之間高效的選擇性保證了胚胎的遺傳性，因此優質的精子和卵子就顯得尤為重要，趙洪鑫等[23]研究發現，試驗組患者精漿ROS 水平較對照組明顯升高，ROS 水平與精子DFI（DNA 碎片指數）呈正相關，表明不育癥男性的精子可發生脂質過氧化反應，導致精子DNA 碎片增加，這就說明了ROS 可引起機體氧化-抗氧化系統的失衡，導致脂質過氧化物損傷，可能與精子細胞膜蛋白質受體和轉運蛋白質的結構改變有關。

ROS 也可以通過影響Caspase 凋亡通路對胚胎發育造成影響。Caspase 凋亡通路作為內質網應激凋亡途徑中的重要組成部分，ROS 可以通過內外兩條途徑引起細胞凋亡，過量的ROS 可以導致細胞脂質過氧化，線粒體通透性轉化，從而激活Caspase 凋亡通路；外源性途徑主要由于一些死亡受體能夠直接激活Caspase 凋亡通路，使得細胞發生凋亡[24]。總之，ROS 可以通過影響精子的質量使得胚胎細胞發育停滯甚至凋亡，最終影響胚胎的妊娠率。

2 減輕ROS 對胚胎損傷的方法

2.1 提高操作熟練技術，調整胚胎最適生長環境 輔助生育技術主要是由體外受精胚胎移植技術（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）和胞漿內單精子注射技術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）組成，從獲卵到受精，再到胚胎培養，整個操作過程都在體外進行。影響ROS 表達量的因素有很多，主要包括體外培養環境和操作過程。前期有研究發現[25]，胚胎在20%氧含量培養后ROS 的表達量明顯高于5%氧培養，傳統的胚胎評分方法需要頻繁開關培養箱，ROS 的表達量就會增多，從而使得胚胎生長沒有一個穩定的內環境，因此延遲攝像技術應運而生，應用該技術動態評估胚胎生長過程，可以大大減輕氧化應激對胚胎影響，從而提高胚胎的利用率。

此外，在體外培養的操作過程中，比如胚胎的觀察、冷凍以及解凍等，由于受到個人技術的熟練程度影響，也會產生不同程度的ROS，這就需要每一位胚胎學家能夠熟練掌握胚胎學操作技術，爭取在最短的時間內，完成整個操作過程，減少ROS 的表達量，減輕對胚胎的損傷，提高胚胎質量。

2.2 生物抗氧化劑干預 ROS 表達量直接影響胚胎的發育，為了減輕這種損傷作用，研究發現[26]，一些生物抗氧化劑能夠抑制ROS 活性，如氮-乙酰半胱氨酸（NAC）、維生素（Vc）、維生素B5（VB5）以及迷迭香酸等。NAC 是一種常見的抗氧化劑，能夠直接與ROS 的代謝離子反應，還可以通過脫乙酰基作用轉化為谷胱甘肽（GSH），其是重要的抗氧化劑能夠清除ROS 等自由基，減少氧化應激損傷；且有研究發現[27]，當其濃度為1 mmol/L 時，胚胎形成囊胚率最高，抗氧效果最佳。Vc 即所謂的L-抗壞血酸性，具有很強的抗氧化性，能夠迅速清除細胞在新陳代謝中產生的一系列氧自由基，與其他的抗氧化劑相比較，它可以與ROS 迅速反應，使胚胎內的低分子量抗氧化劑含量恢復到正常水平，增強其抗氧化作用；VB5作為輔酶A 生物合成所必須的維生素，廣泛存在于各種生命組織中，它可以通過促進脂肪酸代謝來消除脂質過氧化物，阻止ROS 進入胚胎，以此減輕氧化應激對胚胎的損傷[28]。研究發現[29]，迷迭香酸（RA）可以有效減輕氧化應激對豬卵母細胞的損傷，其抗氧化機制可能與其化學結構有關，其中羧酸基團與芳香環中的鄰苯二酚結構共同作用中和自由基。另有研究表明[30]，RA 可以通過降低細胞內ROS水平來抑制H2O2誘導的N2A 細胞的細胞毒性，此外，RA 也有效地減弱β-淀粉樣蛋白誘導的脂質過氧化和減少PC12 細胞中ROS 的積累。

3 總結

隨著社會經濟的快速發展，不孕不育已經成為大家所關注的焦點，輔助生育技術也因此被大家提出，成為了近年來研究的熱點，在其發展的過程中，越來越多的問題引起了科研工作者的關注。影響此項技術的因素有很多，其中氧化應激反應貫穿于整個胚胎的發育過程中。但至今為止，氧化應激對胚胎的影響機制尚未明確，應用不同的干預措施，盡可能的減少氧化應激對胚胎的損傷作用，可為輔助生育技術提供更有利的幫助。