苦丁茶主物質提取及其HPLC指紋圖譜分析

胡 婷，鄒成梅，江吉周,2*

(1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，武漢 430205；2.湖北省地質實驗測試中心自然資源部稀土稀有稀散礦產重點實驗室，武漢 430034)

苦丁茶，冬青科冬青屬植物，是一種常綠喬木，俗稱茶丁、富丁茶、皋盧茶，分布在西南地區及華南地區，在我國民間用于防病治病已經具有悠久的歷史[1].苦丁茶多糖具有抑制特定脂肪細胞的增值和分化的功效[2-5]，黃酮類能通過調節基因片段抑制癌細胞的擴散[6].苦丁茶多酚具有良好的抗氧化活性和保肝功能.潘研霞等[7]建立小鼠四氯化碳誘導肝損傷模型，在添加劑量苦丁茶多酚成分后，小鼠的肝指數下降，小鼠血清中AST、ALT、TG、TC含量減少，病理學形態觀察證明苦丁茶多酚能緩解四氯化碳誘導的肝細胞損傷.Wan等[8-9]研究表明，苦丁茶中的雙酚基奎酸能減輕小鼠結腸炎炎疾病活動指數，促炎細胞因子，苦丁茶活性物質是通過調節腸道微生物群來改善結腸炎病癥.苦丁茶主成分提取方法常見的有酶解法、微波輔提和超聲輔提法等.張海全[10]采用纖維素酶對苦丁茶熊果酸進行酶解，對酶解中的溫度、pH等影響因素進行考察，提取率較高.

高效液相色譜(HPLC)是分析復雜樣品中占據特殊地位，是檢測如中草藥等物質的重要技術手段，HPLC能清晰分辨藥物中的各類活性物質，通過對分離條件的優化，能提高物質的分離效果，在食品、藥品分析等領域使用廣泛，也在指紋圖譜的分析中常見其身影[11-13].中藥指紋圖譜能運用現代分析技術獲得標示某種藥材成分的色譜，從而較全面地反映植物內在組分群的種類和數量，最終客觀評價中藥質量的科學方法，成為分析藥物化學成分的常用手段[14-15].在苦丁茶成分提取并初步優化的基礎上[16]，選擇色譜條件，為建立指紋譜圖提供良好基礎.明確苦丁茶化學組成，可以通過指紋圖譜的建立實現，對其成分的表征和對不同產地苦丁茶成分的研究，分析其中差異，能夠為其藥效物質基礎研究以及質量控制奠定基礎[17].

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10個批次的苦丁茶分別來自海南(S1～S5)、江西(S6、S7)、云南(S8、S9)和福建(S10)四個地區不同藥房采購.

甲醇、乙腈：色譜級，天津市化學試劑一廠；甲醇、乙醇、乙酸：分析級，天津市化學試劑一廠.

KL-100超聲清洗儀：深圳市科力超聲清洗設備有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜：安捷倫科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 試品溶液的制備 樣品預處理：苦丁茶粉碎成末，過60目篩得到苦丁茶粗粉樣品.準確稱取2.0 g苦丁茶粗粉，加入25 mL 75%乙醇溶液提取，提取30 min后抽濾，使用旋轉蒸發儀濃縮，濃縮完成后在25 mL容量瓶定容，補充提取劑至刻度線，搖勻備用.吸取1 mL提取液過0.45 μm濾膜，裝入HPLC樣品瓶中待測.

1.2.2 優化實驗條件[18]

1) 提取方法的選擇.按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，采取超聲和加熱回流兩種提取方法，提取30 min后抽濾，使用旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮完成后補充提取劑至相同體積，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測選擇提取效果最佳的提取方式.

2) 提取溶劑的選擇.按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和7種不同提取劑各25 mL，(水和不同體積分數25 mL的乙醇、甲醇，如50%乙醇、甲醇、75%乙醇、甲醇、100%乙醇、甲醇，)，超聲提取30 min后抽濾，使用旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮完成后補充提取劑至相同體積，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測選擇最佳的提取劑.

3) 超聲時間的選擇.按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，在超聲時間(30、60、90、120 min)下提取，提取完成后抽濾，使用旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮完成后添加溶劑至原來體積位置，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測選擇最佳的提取時間.

4) HPLC色譜條件的選擇[19-21].按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，超聲提取30 min后抽濾，使用旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮完成后補充提取劑至相同體積，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，確定檢測波長為260 nm，在檢測過程中，考察不同比例流動相(甲醇和水、0.1%醋酸、0.5%醋酸；乙腈和水、0.1%醋酸、0.5%醋酸)、緩沖液的洗脫方式及流速(0.2 mL·min-1、0.4 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1)等各個條件下的HPLC色譜的出峰情況.

1.2.3 參照峰的選擇 按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加標品綠原酸2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，即得綠原酸對照品溶液.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測考察綠原酸對照品的出峰情況.

1.2.4 指紋圖譜的建立與評價 樣品檢測后所得各個批次苦丁茶的HPLC指紋圖譜，將數據結果放入“中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A版”中進行處理與分析，生成10批苦丁茶樣品的HPLC指紋圖譜.

1.2.5 方法學考察

1) 精密度試驗.在已經確定的色譜分析條件下，對批號為S1的苦丁茶試品溶液連續進樣5次，記錄260 nm波長下色譜圖，根據有關資料的查詢，選擇參照峰為綠原酸，作為計算的依據，參照峰和保留時間被確定為1，連續5次進樣后，可獲得對應的RSD值.

2) 穩定性試驗.S1批次的苦丁茶按要求制成樣品溶液，設置已確定的色譜條件，選擇時長為0、2、4、6、12 h，綠原酸為參照峰，計算RSD值.

3) 重復性試驗.S1批次的苦丁茶樣品，按優化方案下1.2.2項中顯示方法，按照相同標準平行配置5份樣品溶液，根據已經確定的色譜條件檢測，綠原酸為參照峰，計算RSD值.

2 結果與分析

2.1 提取方法的選擇

如圖1所示，采用相同的提取試劑，兩者所得HPLC指紋圖譜出峰時間及種類都非常相似.但超聲提取法的操作可控性更高，所以選擇超聲輔提方式獲得提取物.

圖1 提取方法的考察Fig.1 Investigation of extraction methods

2.2 提取試劑的選擇

選擇以超聲提取法作為提取方式后，考察比較不同提取劑對苦丁茶主成分提取的影響.如圖2所示，在各提取劑的HPLC圖譜中，主成分的種類相同，從圖中可以看出，進樣量相同時提取率存在差別，其中75%乙醇的分離效果更好，即選75%乙醇作為提取溶劑來進行后面的實驗.

圖2 提取溶劑的考察Fig.2 Investigation of extraction solvents

2.3 超聲時間的選擇

如圖3所示，使用75%乙醇進行超聲提取，不同提取時間的指紋圖譜中提取率的變化不明顯，隨著時間的增加主物質的提取率并未出現增長的現象，從圖中可以看出，提取120 min后，含有的主成分量降低，超聲波具有的機械效應會增大介質的運動速度，使提取劑與所提物質充分接觸提高提取率，與此同時也會造成極大的破壞作用，苦丁茶在較長時間的超聲震動中，會導致結構一定程度的分解，影響主成分的提取，因此提取時間過長是不適宜的，綜合整體情況考慮，30 min的提取時間是合適的選擇.

圖3 提取時間的考察Fig.3 Investigation of extraction time

2.4 HPLC色譜條件的選擇和優化

2.4.1 流動相系統的選擇 采取5種不同系統的流動相解決苦丁茶中含有少量綠原酸帶來的拖尾現象，盡管在加入三乙胺后狀況有所改善，但其自身對實驗會造成一定的影響，因此改變系統中的流動相能從根本上解決兩者的困擾.如圖4所示，在未添加冰醋酸(甲醇—水、乙腈—水)系統中的分離效果較添加冰醋酸的效果差，出現明顯拖尾現象，不作為考慮對象.在加入冰醋酸后，分離度發生改變，冰醋酸的濃度從0.1%增加至0.5%,出峰的形狀和時間趨向于預期效果，比較甲醇—0.5%冰醋酸和乙腈—0.5%冰醋酸的色譜圖可以看出，組分的出峰時間最為合適的是甲醇-0.5%冰醋酸流動相.

2.4.2 洗脫方式的選擇 HPLC法中，存在等度洗脫和梯度洗脫兩種方式，梯度洗脫是指改變鹽的濃度增加洗脫雜質的效果，一般適用于成分復雜，雜峰出現時間晚的情況，等度洗脫的單一濃度對雜質的洗脫效果更佳，但操作也更為復雜.苦丁茶中所含化學成分復雜且極性相差較大，兩者分開使用分離不完全，將兩者結合會有更加的效果.如表1中所示，實驗采取等梯度洗脫的方式結合，極大程度考慮出峰時間晚及分離狀況不佳的現象.圖5中能明顯看出，此洗脫程序應用時出峰時間適中，分離效果好，色譜峰信息較為豐富.

2.4.3 檢測波長的選擇 圖6所示為波長掃描范圍200～400 nm特定波長下的色譜圖，通過不同波長之間的色譜圖進行相互對比發現，260 nm波長下苦丁茶樣品出峰數目較多，色譜峰分離度和均衡性較好，因此，選擇檢測波長為260 nm.

2.4.4 流速的選擇 如圖7所示，在確定洗脫方式后，比較不同流速在260 nm波長檢測下的出峰情況，不同流速下的色譜圖差別較大，0.2 mL·min-1時的色譜圖中主峰和雜峰的相互交錯，主要物質的分離效果不佳，而流速為0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1時樣品中出峰時間過快，且1.0 mL·min-1分離度不佳.對比流速0.4 mL·min-1和0.6 mL·min-1的色譜圖，兩者比較相似，峰形和分離效果都較好，其中流速為0.6 mL·min-1的出峰時間稍早些更為合適，因此選擇流速0.6 mL·min-1最為恰當.

2.5 參照峰的選擇

苦丁茶樣品中化學成分眾多，含有綠原酸等常見物質，因此量取標準品綠原酸溶液4 μL 按照上述選擇的最優色譜條件進樣分析，考察綠原酸作為對照樣品的適宜性.如圖8綠原酸溶液分析的HPLC色譜圖，該圖中色譜峰的出峰時間及響應值都良好，適合作為樣品檢測的參照峰.

圖4 流動相的選擇Fig.4 Investigation of mobile phases

表1 洗脫程序Tab.1 Elution program

2.6 方法學考察

2.6.1 精密度試驗 取S1批號的苦丁茶樣品，按上述提取優化條件制成供試樣液，采用已確定的色譜條件檢測，整理連續5次進樣檢測的數據，計算得到RSD值.如表2所示，共有峰相對保留時間的RSD為0.014 2%～0.135 3%，相對峰面積的RSD為0.257 4%～3.960 9%，在此結果范圍內，儀器精密度合格.

圖5 洗脫程序色譜圖Fig.5 Elution program chromatogram

圖6 HPLC不同檢測波長的考察結果Fig.6 Investigation of different detection wavelength

圖7 HPLC流速的考察Fig.7 Investigation of flow rate

圖8 綠原酸的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC diagram of chlorogenic acid

表2 精密度試驗RSD結果Tab.2 Precision test RSD results %

2.6.2 穩定性試驗 取S1批號的苦丁茶樣品，按上述提取優化條件制成供試樣液，按最優色譜條件檢測，考察樣品在0、2、4、6、12 h內的穩定性，計算得到RSD值，結果如表3所示.從表中可以看出，各共有峰的相對保留時間的RSD為0.021 5%～0.139 1%，相對峰面積的RSD為0.542 6%～3.924 1%，數據結果顯示該苦丁茶樣品溶液在12 h內具有穩定性.

2.6.3 重復性試驗 取S1批號的苦丁茶樣品，按上述提取優化條件制成供試樣液，平行制備5份，進行檢測.如表4結果顯示，共有峰相對保留時間的RSD為0.013 2%～0.133 2%，相對峰面積的RSD為0.642 3%～4.047 0%，樣品溶液在該優化條件下檢測重現性較好.

表3 穩定性試驗RSD結果Tab.3 Stability test RSD results %

表4 重復性試驗RSD結果Tab.4 RSD results of repeated tests %

2.7 建立指紋圖譜與相似度評價

2.7.1 10批苦丁茶樣品指紋圖譜建立 指紋圖譜的建立及研究結果可為后續苦丁茶藥效物質基礎研究奠定基礎.按照前文中最優提取條件將各地區藥房中得到的不同批次苦丁茶樣品制備成供檢測樣液，總計10批樣品溶液.按照最優色譜條件依次檢測，得到來自不同藥房10批苦丁茶的HPLC色譜圖，如圖9所示.圖10是利用軟件“中藥指紋圖譜相似度評價系統”處理后的對照HPLC指紋圖譜，而此實驗的完成，能初步對苦丁茶的主成分進行表征，是苦丁茶藥物藥效研究的重要環節.

圖9 10批苦丁茶樣品的HPLC圖譜Fig.9 HPLC analysis of 10 batches of Ilex latifolia Thunb.samples

圖10 苦丁茶對照指紋圖譜Fig.10 Reference fingerprint of Ilex latifolia Thunb.

表5中可以看出相對峰面積RSD最高達到39.031 0%，最低為15.683 6%，結果表明，各批次苦丁茶的組分含量之間存在較大差異，10批苦丁茶產地的種植條件，環境氣候以及貯存方式都可能是產生此現象的原因.

表5 10批苦丁茶指紋圖譜共有峰RSD結果Tab.5 RSD results were found in fingerprints of 10 batches of Ilex latifolia Thunb. %

2.7.2 相似度評價 表6中可知，軟件數據處理時可直接匹配10批苦丁茶的指紋峰，與已有的共有模型測定相關性，最終數據為10批樣品相似度均>0.9，符合中藥指紋圖譜技術要求.

表5、6的結果顯示，10批苦丁茶的相對保留時間RSD值<1%，所含化學成分保持一致，相似度>0.9，符合中藥指紋圖譜技術要求，表明不同批次樣品雖然存在各種影響組分含量差異的原因，但其基本比例還會保持一定水平，對實驗過程中影響相對較小，建立苦丁茶HPLC指紋圖譜能真實反映質與量的關系，幫助苦丁茶的藥效物質基礎研究及其質量控制提供科學依據.

表6 10批不同產地苦丁茶相似度Tab.6 Similarity of 10 batches of Ilex latifolia Thunb.from different origins

3 結論

本實驗在綜合考慮苦丁茶樣品的提取率和組分含量后，對供試樣品制備過程中的提取方式、提取時間以及提取試劑等三個方面進行了優化.加熱提取和超聲提取的色譜圖差異小，相似度高，但從操作簡便的角度看，超聲提取更具優勢.在同種提取方式下，考察了不同提取溶劑對苦丁茶提取率高低，最終選擇75%乙醇作為提取劑.確定提取方式和提取溶劑后，比較不同超聲時間30 min、60 min、90 min、120 min的適宜性，結果顯示，隨著時間的增長提取率變化不大，且超聲時間過長對苦丁茶的成分結構有破壞，因此選擇30 min作為超聲提取時間.HPLC能清晰分辨藥物中的各類活性物質，分離條件的優化，在主成分分離和組分種類分析中具有重要作用，確定了流動相為甲醇—0.5%醋酸、等梯度洗脫方式、吸收波長為260 nm、流速為0.6 mL·min-1的最優色譜條件，通過對分離條件的優化，則會減少進樣物質不必要的損耗，出峰效果上也能有很好的輔助作用.精密度、穩定性、重復性方法學實驗，是一項保證實驗數據縝密的程序性流程，很大程度上增加數據的嚴謹性.結果表明實驗所用儀器的精密度良好，樣品溶液12 h內保持較高穩定性，在優化的提取方式和檢測條件下樣品展現良好重復性.實驗成功建立苦丁茶的指紋圖譜，實現苦丁茶主物質初步探究，并在相應的軟件中，對10批苦丁茶樣品的共有峰進行評價，結果為10批樣品相似度均>0.9，符合要求.