基于系統藥理學探討消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變機制*

陳婷婷，沈衛星，程海波

南京中醫藥大學/江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇南京210023

結直腸癌已躍居全球癌癥相關死亡原因的第三位［1］。其中結直腸腺瘤性息肉作為結直腸癌主要的癌前病變，已有確鑿證據表明其是結腸癌發病的高危因素，流行病學資料顯示腺瘤發病率越高則腸癌發病率也越高，且相關機制研究已形成“腺瘤-癌變”假說［2］。腸鏡下切除術作為結直腸腺瘤性息肉的主要治療手段，可降低但不能長期預防腺瘤性息肉的再發或癌變，當前多采取非甾體抗炎藥、阿司匹林、適當補充鈣劑和維生素D、生活飲食習慣調護等來預防結直腸腺瘤性息肉的復發、癌變。目前，尚未見公認的預防結直腸腺瘤性息肉復發、癌變的標準治療方案［3］。

中醫“治未病”理論體系隨時代的不斷發展，促使中醫藥防治結直腸惡性腫瘤逐漸成為臨床研究重點。依托國醫大師周仲瑛教授的“癌毒”病機理論、臨床實踐，筆者提出結直腸腺瘤性息肉的基本病機為“脾虛毒蘊”，并創立了防治結直腸腺瘤性息肉復發、癌變的中藥復方“消癌解毒方”（白花蛇舌草、苦參、黨參、白術、烏梅、黃連），大樣本臨床隨機觀察尚在研究中。前期研究發現該藥能夠降低結直腸腺瘤性息肉再復發及疾病惡化（異型增生、癌變）。

網絡藥理學是一門從系統層面研究中醫藥的新興學科，運用生物網絡數據庫和相關分析技術構建“藥物-靶點-疾病”之間復雜網絡關系，可快速、系統地預測和分析藥物作用潛在機制。本研究擬應用網絡藥理學相關技術，分析消癌解毒方中主要核心藥物防治結直腸腺瘤性息肉癌變的作用靶標、信號通路，并進行相關潛在機制的分類富集分析，揭示消癌解毒方通過多靶點、多通路防治疾病不良病變的思路和依據［4-5］。

1 資料與方法

1.1 構建消癌解毒方對應化學成分數據集依托中藥系統藥理學數據庫（traditional Chinesemedicine systems pharmacology，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/index.php），檢索白花蛇舌草（Hedyotis Diffusae Herba）、苦參（Sophorae Flavescentis Radix）、黨參（Codonopsis Radix）、白術（Atractylodes Macrocephala Koidz）、烏梅（Mume Fructus）、黃連（Coptidis Rhizoma）對應的化學成分，設定藥物口服生物利用度（oral Bioavailability，OB）值≥30%且藥物相似性（drug Similarity，DL）≥0.15為篩選條件，建立對應中藥的化學成分數據集。

1.2 構建消癌解毒方化學成分對應靶點數據集

借助TCMSP數據庫檢索篩選得到的各化學成分對應靶點，構建化合物對應靶點數據庫。用于研究口服消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變的潛在機制。

1.3 構建結直腸腺瘤性息肉和結直腸癌疾病對應靶點庫分別以“Colorectal Adenoma”“Colorectal cancer”為關鍵詞，查閱人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM:https://omim.org/）、治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD:http://db.idrblab.net/ttd/）、藥物基因組學 知 識 庫 （Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGkb:https://www.pharmgkb.org/）及疾病基因搜索系統（Disease Gene Search Engine with Evidence Sentences，DiGSeE:http://210.107.182.61/geneSearch/）收集對應靶點，構建對應的疾病-靶點數據庫。

1.4 構建“消癌解毒方-化合物-關鍵靶點”子網絡通過蛋白數據庫（Uniprot:http://www.uniprot.org/）對化合物對應靶點和疾病對應靶點進行校正和統一。運用生物信息學與進化基因組學平臺（Bioinformatics＆ Evolutionary Genomics:http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將校準后的靶點取交集提取關鍵靶點。同時通過Cytoscape（3.2.1）（http://cytoscapeweb.cytoscape.org/）構建中藥-化合物-靶點網絡和疾病-靶點網絡，將兩網絡進行整合，結合Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平臺得到的關鍵靶點，最終提取整合后的網絡中關鍵靶點所對應的網絡圖，形成中藥-化合物-關鍵靶點網絡并進行分析。

1.5 對關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析基因本體（gene ontology，GO）是一個基因功能分類的標準化系統，常見的3個主要分類包括生物學過程（biological process）、細胞成分（cellular components）和分子功能（molecular function）［6］，運用Enrichr數據庫（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）對關鍵潛在靶點進行GO功能富集分析，同時下載京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路相關數據，在omicshare軟件平臺（https://www.omicshare.com）進行富集，從系統生物學角度對消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變潛在機制進行預測。

2 結果

2.1 消癌解毒方對應化合物TCMSP數據庫檢索到符合篩選條件的中藥白花蛇舌草對應的化合物7個、苦參對應的化合物43個、黨參對應的化合物19個、白術對應的化合物7個、烏梅對應的化合物8個、黃連對應的化合物10個，為進一步檢索各化合物對應靶點做準備。

2.2 消癌解毒方化學成分對應靶點在TCMSP數據庫對符合篩選條件的各化學成分對應靶點進行檢索，其中白花蛇舌草對應的7個化合物中有5個化合物有對應的靶點236個，苦參對應的43個化合物可檢索到對應靶點509個，黨參對應的16個化合物可檢索到對應靶點211個，白術對應的4個化合物可檢索到對應靶點23個，烏梅對應的8個化合物可檢索到對應靶點302個，黃連對應的9個化學成分可檢索到對應靶點264個。將上述各化合物對應靶點合并，共得到1 545個對應化合物靶點，其中唯一靶點243個，為進一步構建化合物-靶點網絡，研究口服消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變的潛在機制做準備。

2.3 結直腸腺瘤性息肉與結直腸癌疾病對應靶點

以對應的疾病名在OMIM、TTD、PharmGkb及DiGSeE數據庫進行檢索、收集對應靶點，并通過Uniprot數據庫選擇“Homo sapiens”對兩種疾病及消癌解毒方所含化合物對應靶點進行校正和統一，共得到“Colorectal Adenoma”對應唯一靶點3 279個、“Colorectal cancer”對應唯一靶點4 119個、消癌解毒方所含化合物對應唯一靶點235個，將三者的靶點通過Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平臺取交集（見圖1），結直腸癌、結直腸腺瘤性息肉與消癌解毒方共有相同靶點110個，將其設定為消癌解毒方治療結直腸腺瘤性息肉癌變的關鍵潛在靶點，為構建中藥-化學成分-關鍵靶點網絡做準備。

2.4 “消癌解毒方-化合物-關鍵靶點”網絡的構建運用Cytoscape軟件分別構建中藥-化合物-關鍵靶點網絡和疾病-靶點網絡，并進行整合得到中藥-化合物-疾病-靶點網絡，結合2.3項下110個關鍵潛在靶點信息，提取關鍵靶點相關子網絡，形成“消癌解毒方-化合物-關鍵靶點”網絡（圖2，其中三角形代表消癌解毒方、六邊形代表各味中藥，圓形代表靶點和化合物，節點顏色越深代表節點度賦值越高）。圖2網絡中，共包含213個節點、556條邊，以節點度值Degree≥20為界，得到消癌解毒方包含的中藥苦參、黨參對應的節點度值分別為44、20，為該網絡中的關鍵中藥；槲皮素（quercetin）、木樨草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）節點度值分別為86、43、38、20，為該網絡中較為重要的有效成分；相關靶點中環加氧酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、環加氧酶1（prostaglandin endoperoxide synthase 1，PTGS1）、核受體輔激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）節點度值分別為39、30、24、20，為該網絡中的關鍵作用靶點。

圖1 腸癌、腸腺瘤、消癌解毒方對應靶點韋恩圖

圖2 關鍵潛在靶點的中藥-化合物-關鍵靶點網絡圖

2.5 關鍵靶點的GO富集結果結合Enrichr數據庫功能，對110個關鍵潛在靶點進行GO功能富集（見圖3），富集后得到參與生物過程的關鍵靶點分別為:白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、細胞核因子κp65蛋白（nuclear factor-KBp65，RelA）、蘇氨酸蛋白激酶1（protein-threonine kinases AKT1）、血管內皮生長因子A（vascular endothlial growth factor，VEGFA）、沉默信息調節因子1（Sirtuin1，SIRT1）、抑癌基因P53（Tumor Protein P53，TP53）等，作用的生物學過程主要集中在細胞對刺激因子的反應、凋亡過程的調控、細胞因子介導的信號通路、程序性細胞死亡的負調控、基因表達的正調控、核酸轉錄的正調控、細胞對活性氧的反應、轉錄正調控、細胞增殖調控、細胞內信號轉導的調控、MAPK級聯激活（Mitogen-activated protein kinase cascade，MAPK cascade）的正向調節、細胞對氧化應激的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄調控、蛋白質磷酸化的正調控等。富集得到的參與細胞成分的關鍵靶點分別為:TP53、沉默信息調節因子1（Silent information regulator，SIRT1）、核轉錄因子激活蛋白1（Activator protein-1，AP-1）、重組人有絲分裂原激活蛋白激酶1（Recombinant Human Mitogen-Activated Protein Kinase 1，MAPK1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARD）、轉錄因子1（E2F Transcription Factor 1，E2F1）、重組人谷胱甘肽S-轉移酶Pi1（Recombinant Human Glutathione S-Transferase pi 1，GSTP1）等，作用的細胞成分主要集中在細胞分泌顆粒管腔、細胞質膜穴樣內陷、細胞核染色體部分、脂膜筏、血小板α顆粒管腔、線粒體外膜、細胞質囊腔等。富集得到參與分子功能的關鍵靶點有:TP53、RelA、ESR1、AP-1、EGFR、重組人受體酪氨酸激酶（recombinant human tyrosine kinase receptor ErbB-3，ErbB-3）、糖皮質激素受體（nuclear receptor subfamily 3 group Cmember 1，NR3C1）等，作用的分子功能主要包括蛋白激酶結合因子、泛素樣蛋白連接酶結合因子、轉錄調控區DNA結合因子、核心啟動子結合因子、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性因子、RNA聚合酶II轉錄因子結合因子、核心啟動子近端序列特異性DNA結合因子等。

圖3 關鍵潛在靶點的GO富集分析圖

2.6 關鍵靶點的KEGG富集結果從Enrichr數據庫下載KEGG通路相關數據，轉換為omicshare平臺相匹配的格式后進行分析，共得到KEGG富集通路108條，其中P＜0.01的有88條，基因富集數量最高為42個、最低為2個。采用P值和基因富集數量交叉篩選的方法，篩選出富集排名前20位的信號通路［7］（見圖4）。可見消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變的關鍵潛在靶點富集得到的主要信號通路包括癌癥途徑、前列腺癌、AGE-RAGE信號通路、乙型病毒性肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、人巨細胞病毒感染、胰腺癌、EB病毒感染、麻疹、人T細胞白血病病毒1型感染、癌癥中的蛋白多糖、丙型病毒性肝炎、膀胱癌、細胞衰老、細胞凋亡、小細胞肺癌途徑等。

圖4 關鍵潛在靶點的KEGG富集分析圖

3 討論

防治結直腸腺瘤性息肉癌變和復發的消癌解毒方，主要由黨參、苦參、白術、黃連、烏梅、白花蛇舌草等組成。其中黨參、白術主補氣虛、血虛，調和健脾［8-10］；白花蛇舌草、苦參、黃連專于解毒，尤以熱毒、濕毒為主，并可防治癌毒；烏梅不僅可下虛火、固腸脫，其性多有收澀、瀉下、重鎮的特點，是為沉降之藥，而且可作為引經藥，引藥入腸腑［11］。除核心藥物外，另有助祛腸腑寒濕藥輔助，這些藥物之間的制化協助關系，保持人身整體的協調平衡和機體內環境的統一。

疾病與機體之間的相互關聯作用機制錯綜復雜，致病因素反饋過程的機理也縱橫交錯，治療的藥物只有通過多途徑、多系統協調，才能發揮相對有效的防治疾病作用。本研究通過網絡分析，預測消癌解毒方可對結直腸腺瘤性息肉、結直腸癌的多個靶點、多個通路發揮作用，其中槲皮素、木樨草素、山柰酚等成分已經過論證具有防治結直腸癌變的作用［12］。既往研究顯示，姜黃素和槲皮素聯合防治腸腺瘤復發和癌變可能具有一定療效，作用機制主要為阻滯細胞周期、抑制細胞侵襲及轉移、調節腫瘤信號轉導通路、抑制相關基因與蛋白的表達等［13］。木樨草素通過抑制Wnt/β-catenin/TCF-4信號通路來抑制結直腸癌［14］。山柰酚則通過上調p53的蛋白表達量抑制結腸癌細胞增殖［15］。上述已有的研究結果與預測結果基本一致，提示消癌解毒方主要有效成分對結直腸腺瘤性息肉癌變具有一定的防治作用。

結合上述GO富集分析結果，消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變的潛在靶基因富集結果顯示，其作用的主要關鍵靶點有TP53、SIRT1、JUN、RELA、EGFR、IKBKB、IRF1等。TP53突變是惡性腫瘤發展的潛在預測因子，是促使腺瘤向腺癌轉變的關鍵步驟［16-17］。SIRT1是腺瘤癌變過程中的重要物質［18］。SIRT1與P53可能起協同作用促進結腸癌的發生［19］。JUN參與結直腸癌疾病進程，可能成為結直腸癌預防和治療的潛在靶點［20］。RELA通路促進腸上皮細胞趨向疾病［21］。EGFR、P53基因均參與結直腸腺瘤性息肉癌變，EGFR可能作用于早期，P53基因則可能作用于晚期［22］。因此檢測EGFR、P53對早期診斷結直腸腺瘤性息肉癌變有一定的臨床意義。IKBKB參與多種免疫細胞對激活刺激的反應［23］，可能通過免疫受損促進腸上皮細胞癌變。IRF1通過抑制RAS-RAC1通路抑制大腸癌細胞的增殖和轉移［24］，其在結直腸癌組織中表達下調，功能上發揮抑癌作用［25］。通過分析可知，SIRT1、P53、JUN、RELA、IKBKB可促進腸癌的發生，為消癌解毒方預防和治療結直腸腺瘤性息肉癌變的潛在作用靶點；EGFR、P53基因則可作為消癌解毒方逆轉腺瘤癌變的關鍵靶點；IRF1則可作為消癌解毒方抑制結直腸癌變的潛在靶點進行深入研究。

KEGG通路富集結果主要集中在PI3K-Akt、IL-17、腫瘤壞死因子等通路上，涉及免疫炎癥反應、代謝、細胞分化和凋亡等多個復雜的生物學系統。PI3K-AKT這一自噬經典信號通路與結腸癌轉移關系密切［26］。IL-17在結直腸癌組織中表達水平最高、癌旁組織次之、正常黏膜組織最低［27］。該信號通路可能為結腸癌發生發展過程中的重要促進因子。腫瘤壞死因子、表皮生長因子受體在結直腸腺瘤性息肉組織中表達均高于正常大腸黏膜組織，兩者相關的通路可能在結直腸腺瘤性息肉的發生和發展過程中發揮重要作用［28］。晚期結腸癌腫瘤組織TNF-α、IL-6陽性表達率均高于早期，證明TNF-α和IL-6在結直腸癌發生、發展中起免疫調節作用［29］。由此可見，與免疫炎癥反應、細胞衰老和凋亡等疾病相關的通路也有可能成為消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變的靶點。

本研究基于系統思維的方法，運用網絡藥理學相關技術，對消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變的潛在作用機制進行預測。結果發現，消癌解毒方中的槲皮素、木樨草素、山柰酚等有效化合物可能通過PI3K/Akt信號通路、IL-17信號通路、癌癥中的蛋白多糖、細胞衰老、細胞凋亡等信號通路，作用于PTGS2、PTGS1、IL6、EGFR、AKT1、TP53、JUN等關鍵靶蛋白而發揮防治結直腸腺瘤性息肉癌變的功效。從系統生物學角度對消癌解毒方防治結直腸腺瘤性息肉癌變潛在機制進行預測結果的分析，符合中醫運用復方中藥多組分、多系統、多靶點、多途徑整體調理機體、防治疾病的特點。但運用多個數據庫篩選核心化合物和靶標、多個軟件平臺處理數據、多組文獻研究進行印證分析結果，均不夠客觀，可能在以上研究中混雜較多影響因素，導致輸出或分析結果存在一定的局限性，故需要今后努力在基礎和臨床研究中將預測結果進行深入驗證。