木薯蠶絲的13C CP/MAS NMR分析

陳靜 黃繼偉 彭澤冶 寧晚娥

摘要： 木薯蠶絲作為一種極具開發利用價值的野蠶絲，其結晶結構、熱學性質和力學性能顯著不同于桑蠶絲，對木薯蠶絲二級結構的研究有助于進一步認識其構效關系，拓展其應用領域。13C CP/MAS NMR技術是研究蠶絲絲素蛋白結構的有效方法之一。文章通過13C CP/MAS NMR測試，分析了木薯蠶絲絲素蛋白的二級結構特征，并將其與桑蠶絲和柞蠶絲進行了對比。結果表明：桑蠶絲中Gly的含量較柞蠶絲和木薯蠶絲高，木薯蠶絲與柞蠶絲相近;Ala的含量及其β-sheet結構較柞蠶絲和木薯蠶絲低，木薯蠶絲最高，三者的α-螺旋結構相差不大;桑蠶絲的不定形區含量最高，木薯蠶絲最低，與柞蠶絲接近。

關鍵詞： 木薯蠶絲;桑蠶絲;柞蠶絲;絲素蛋白;二級結構;13C CP/MAS NMR

中圖分類號： TS102.333

文獻標志碼： A

文章編號： 10017003（2021）01000107

引用頁碼： 011101

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.01.001（篇序）

13C CP/MAS NMR analysis of cassava silk

CHEN Jing1， HUANG Jiwei1，2， PENG Zeye1， NING Wane1

（1.College of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China;2.College of Textile and Clothing Engineering， Soochow University， Suzhou 215123， China）

Abstract：

Cassava silk as a kind of wild silk with great development and utilization value， is significantly different from mulberry silk in terms of the crystal structure， thermal properties and mechanical properties. The study on the secondary structure of cassava silk can help to further understand its structure-activity relationship and expand its application field. 13C CP/MAS NMR is an effective method to study the structure of silk fibroin. By 13C CP/MAS NMR test， the secondary structure characteristics of cassava silk were analyzed， and then compared with those of mulberry silk and tussah silk. The results showed that the content of Gly in mulberry silk was higher than that in tussah silk and cassava silk， and the content of Gly in tussah silk and cassava silk was close. The content of Ala and β-sheet structure were lower than those of tussah silk and cassava silk， which were the highest in cassava silk. There was no significant difference in α-helix structure among the three. The content of amorphous region in mulberry silk was the highest， and that of cassava silk was the lowest， which was close to tussah silk.

Key words：

cassava silk; mulberry silk; tussah silk; silk fibroin; secondary structure; 13C CP/MAS NMR

木薯蠶絲是由喂食木薯葉的蓖麻蠶吐絲形成，是一種重要的絲制品原料，可被用于生產高檔蠶絲被、絹紡紗及織物等產品[1-5]。木薯蠶絲還是重要的天然蛋白質原料來源，具有良好的生物相容性、可控的生物降解性、無毒和低免疫源性等特點，在生物醫用材料、食品和精細化學品等領域被廣泛關注[6-8]。近年來，一系列有關木薯蠶絲的加工與處理方法被報道，包括脫膠、整理與改性等[9-12]，這些報道為木薯蠶絲的進一步開發與利用提供了參考。同時，木薯蠶絲結構與性能的研究也逐漸深入。楊瑩瑩等[13]通過掃描電鏡、X射線衍射、紅外光譜和力學性能測試等手段詳細對比了木薯蠶絲與桑蠶絲和柞蠶絲之間的差異。結果表明，木薯蠶絲呈現扁平的帶狀，具有高度的β-折疊結構，富含丙氨酸（Ala-Ala-Ala）結晶單元，木薯蠶絲的斷裂強度和斷裂伸長率均優于桑蠶絲，與柞蠶絲相似。黃繼偉等[14]通過微商熱重法、差示掃描量熱法和動態熱機械分析法等一系列熱分析手段對木薯蠶絲的熱學性能進行了表征，并與桑蠶絲和柞蠶絲進行了對比。結果表明，木薯蠶絲比桑蠶絲具有更好的熱穩定性，略好于柞蠶絲。這些研究進一步拓展了人們對木薯蠶絲結構與性能的認識，為深度開發和利用木薯蠶絲提供了數據基礎。

核磁是研究蛋白質結構的有效方法，隨著固態交叉極化/魔角旋轉（CP/MAS）NMR技術的發展，在利用核磁技術研究蠶絲及其絲素蛋白的結構上取得了顯著的成果[15]。ASAKURA等[16-17]通過對蠶絲絲素紡前和紡后的13C化學位移進行分析，研究發現蠶絲絲素在受溶劑、機械處理和拉伸、壓縮等力學處理時會導致silk Ⅰ向silk Ⅱ發生結構轉變，且silk Ⅰ到silk Ⅱ的結構轉變只發生在蠶絲絲素蛋白的重復（AGSGAG）n區，主要表現為α-helix構象向β-sheet構象的轉變;并探究得到絲氨酸（Ser）的OγH基團可能參與分子間氫鍵的形成，從而有助于β-sheet的形成，促進了silk Ⅱ結構的形成，而酪氨酸（Tyr）則可以有效地破壞β-sheet構象的層狀結構，導致局部結構無序，不利于silk Ⅱ結構的形成[18-19];進一步通過對silk Ⅰ和silk Ⅱ這兩種絲素蛋白的Ala、Ser和Gly殘基的13C CP/MAS NMR化學位移進行分析，制得了化學位移等值線圖，確定了silk Ⅰ和silk Ⅱ的構象[20-21]。這些研究不僅為人們認識和了解絲蛋白二級結構提供了參考，更為利用13C CP/MAS NMR技術研究絲蛋白二級結構提供了方法啟示。同時，這些研究也表明13C CP/MAS NMR方法不僅可以粗略地定量分析蠶絲的主要氨基酸組成，更主要的是可提供蠶絲絲素的構象信息。因此，本文利用13C CP/MAS NMR技術對木薯蠶絲的二級結構進行了測試與分析，并將其與桑蠶絲和柞蠶絲進行對比，分析三種蠶絲的氨基酸的組成及結構上的差異，以期為進一步深入認識木薯蠶絲的結構特征提供參考。

1 實 驗

1.1 材 料

2017年春季在柳城縣收購的桑蠶繭（廣西壯族自治區柳州市柳城鵬鑫源繭絲綢有限公司），2017年春季飼養的柞蠶繭和木薯蠶繭（廣西壯族自治區蠶業技術推廣總站），滲透劑JFC（山東優索化工科技有限公司），碳酸鈉、碳酸氫鈉（永華化學科技（江蘇）有限公司），雙氧水（荊州雙雄化工科技有限公司），上述所用試劑均為分析純。

1.2 儀 器

YB 71旦尼爾電子天平（常州市幸運電子設備有限公司），HH-6數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），Y（B） 802 N八籃恒溫烘箱（溫州大榮紡織儀器有限公司），Agilent-NMR-VNMRS 600型核磁共振儀（美國安捷倫公司）。

1.3 方 法

1.3.1 蠶絲準備與脫膠處理

1）蠶絲準備：分別取桑蠶繭、柞蠶繭和木薯蠶繭若干粒，剝去繭衣，取出蠶蛹，將蠶繭上的蠶絲撕扯至蓬松狀態，備用。

2）蠶絲脫膠處理：因桑蠶繭絲與柞蠶繭絲、木薯蠶繭絲的表面性狀、雜質及含膠量不同，故實驗采用了兩種脫膠工藝，分別對桑蠶繭絲和柞蠶繭絲、木薯蠶繭絲進行脫膠。

桑蠶絲脫膠方法：取一定量的桑蠶繭絲放入質量分數05%的Na2CO3溶液中（浴比1︰100），在100 ℃恒溫水浴鍋中水浴75 min，取出后在40 ℃的溫水中清洗2～3次，再進行第二次脫膠，溶液配比和過程與第一次一致，水浴時間為60 min，取出脫膠后的蠶絲在去離子水中清洗2～3次。

柞蠶絲及木薯蠶絲脫膠方法：配置1 000 mL脫膠溶液（質量分數5%的Na2CO3、質量分數0.1%的滲透劑JFC、質量分數1%的30%濃度的H2O2）加入燒杯，取一定量的柞蠶絲和木薯蠶絲分別放入溶液中（浴比1︰100），在100 ℃恒溫水浴鍋中水浴45 min后取出，用去離子水清洗2～3次后進行二次脫膠，二次脫膠溶液為0.5% NaHCO3溶液，其他配比不變，水浴時間為60 min。

1.3.2 核磁共振測試

采用600 MHz（14.1T）的Agilent-NMR-VNMRS 600 NMR譜儀，13C的共振頻率150 MHz，在氮化硼“雙軸承轉子”中分別測定三種約200 mg以丙酮溶液為溶劑的蠶絲絲素樣品，旋轉頻率約5 kHz，探針溫度80 ℃，由TCI三共振反式超低溫探頭維持，90°脈沖寬度4.3 μs，單脈沖序列接觸時間1 ms，脈沖重復時間間隔2 s。總共收集了1 024次掃描，弛豫延遲5 s，所得到的13C CP/MAS NMR圖譜中的化學位移參考外部金剛烷，從TMS轉化為ppm，其光譜寬度為200 ppm。

2 結果與分析

2.1 蠶絲的13C CP/MAS NMR圖譜

蠶絲絲素蛋白由18種氨基酸組成，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸和天門冬氨酸5種主要氨基酸的總和約占90%[22]。對于不同種類的蠶絲，這5種主要氨基酸的含量又略有不同[23-24]。其中，桑蠶絲的主要氨基酸摩爾比例為甘氨酸約占42.9%、丙氨酸約占30%、絲氨酸約占12.2%、酪氨酸約占4.8%、天門冬氨酸約占1.9%;柞蠶絲的主要氨基酸摩爾比例為甘氨酸約占26.7%、丙氨酸約占48.1%、絲氨酸約占9.1%、酪氨酸約占4.1%、天門冬氨酸約占4.2%;木薯（蓖麻）蠶絲的主要氨基酸摩爾比例為甘氨酸約占33.2%、丙氨酸約占48.4%、絲氨酸約占5.5%、酪氨酸約占4.5%、天門冬氨酸約占2.7%。13C CP/MAS NMR技術可清晰地分辨出上述5種主要氨基酸中的4種，即甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸，其他氨基酸的峰位通常會被掩蓋，并不容易辨識[25]。

圖1為三種蠶絲的13C CP/MAS NMR圖譜，圖譜中可清晰地辨識出甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）的化學位移。圖1（a）中，各峰的化學位移及其對應的氨基酸為20.11 ppm（Ala Cβ）、42.32 ppm（Gly Cα）、48.55 ppm（Ala Cα）、54.18 ppm（Ser Cα）、97.18 ppm（SSB）、114.60 ppm（Tyr Cε）、128.90 ppm（Tyr Cγ）、169.13 ppm（Gly CO）;圖1（b）

中，各峰化學位移及其對應的氨基酸為19.86 ppm（Ala Cβ）、42.23 ppm（Gly Cα）、48.20 ppm（Ala Cα）、99.01 ppm（SSB）、115.09 ppm（Tyr Cε）、129.58 ppm（Tyr Cγ）、155.46 ppm（Tyr Cξ）、171.09 ppm（Gly CO）;圖1（c）中，各峰化學位移及其對應的氨基酸為19.80 ppm（Ala Cβ）、42.34 ppm（Gly Cα）、48.07 ppm（Ala Cα）、99.95 ppm（SSB）、114.58 ppm（Tyr Cε）、129.56 ppm（Tyr Cγ）、155.17（Tyr Cξ）、171.12 ppm（Gly CO）[26-28]。對比三種蠶絲的圖譜可知，桑蠶絲中甘氨酸（42.32 ppm處）的相對強度明顯高于其他氨基酸，而在柞蠶絲和木薯蠶絲中丙氨酸（48.20 ppm處）的相對強度最大，這印證了桑蠶絲中甘氨酸含量最多，而柞蠶絲和木薯蠶絲中丙氨酸的含量最多。為了進一步定量分析各氨基酸相對含量及二級結果的差異，還需要對其進行分峰處理。

2.2 譜峰擬合與二級結構分析

利用Fityk軟件，選用Gaussian線形，對圖1中三種蠶絲的13C CP/MAS NMR譜進行分峰擬合處理，結果如圖2所示。各峰對應的化學位移、譜峰面積和譜峰歸屬，如表1所示。

根據表1中各氨基酸特征峰對應的化學位移、譜峰面積和譜峰歸屬，對同氨基酸同特征峰類型的面積之和占總譜面積的百分比進行分類計算，結果如表2所示。

由表2可知，木薯蠶絲中的Gly的相對含量與柞蠶絲接近，但均小于桑蠶絲;就Ala而言，木薯蠶絲的β-sheet結構大于柞蠶絲，而柞蠶絲又大于桑蠶絲，三者的α-helix結構接近。而Ser的相對含量顯示，木薯蠶絲小于柞蠶絲和桑蠶絲。這些結果說明，木薯蠶絲和柞蠶絲以Ala為主形成結晶結構，而桑蠶絲則以Gly和Ala為主形成結晶結構。與楊瑩瑩等[13]、王晶等[29]的研究情況相符，即木薯蠶絲和柞蠶絲絲素的結晶區主要以（Ala—Ala—Ala）肽鏈結構存在，桑蠶絲絲素的結晶區主要以（Ala—Gly—Ala—Gly）肽鏈結構存在。

根據表1各氨基酸特征峰對應的化學位移、譜峰面積和譜峰歸屬，以譜峰區域劃分[30-31]，計算各譜峰區面積占總譜面積的百分比，結果如表3所示。

由表3可知，在譜峰區15～30 ppm，柞蠶絲和木薯蠶絲的相對強度比桑蠶絲高，柞蠶絲和木薯蠶絲相近;譜峰區在30～48 ppm，桑蠶絲的相對強度比柞蠶絲和木薯蠶絲高，柞蠶絲和木薯蠶絲相近。根據文獻[32]可知，在15～30 ppm譜峰區主要分布著Ala，在30～48 ppm譜峰區主要分布著Gly，這進一步說明了柞蠶絲和木薯蠶絲的Ala含量較桑蠶絲高，桑蠶絲的Gly含量較柞蠶絲和木薯蠶絲高。

根據文獻[30]，本文對各蠶絲中主要氨基酸特征峰在各譜峰區所占的比例進行計算，定量比較蠶絲的各主要氨基酸碳峰，用以說明不同氨基酸二級結構在其對應的譜峰區中的比例，如表4所示。

由表4可知，在16～18 ppm譜峰區內，主要為Ala的α-helix構象，在20～30、48～53 ppm譜峰區內主要為Ala的β-sheet構象，三種蠶絲在16～18 ppm譜峰區內的Ala的α-helix構象的含量相近，柞蠶絲和木薯蠶絲兩者在20～30、48～53 ppm譜峰區內的Ala的β-sheet構象的含量較桑蠶絲高。另外，40～43 ppm譜峰區內三種蠶絲均只有一個Gly Cα峰，說明該區域幾乎全部來源于Gly Cα的貢獻，即可認為接近100%。

蠶絲屬于典型的半結晶聚合物，存在結晶區和不定形區，其中結晶區主要由反平行β-sheet結構構成，不定形區是由無規則線圈和松散螺旋結構組成[33-34]。通過三種蠶絲的13C CP/MAS NMR譜圖及分峰擬合結果可知，Ala呈現出典型的Cα和Cβ構象，分別代表了Ala在無定形中的構象和結晶區中的構象。進一步地，韓秀文等[30]認為，Ala在不定形區和結晶區的含量是不同的（如桑蠶絲Ala結晶區占32%，不定形區占19%;柞蠶絲和木薯蠶絲在結晶區占54%，不定形區占32%），紀濤等[31]認為采用15～30 ppm譜峰區中Ala Cβ（α）和Ala Cβ（β）兩者的譜峰面積比及無定形區和結晶區Ala的不同含量，可粗略估算出蠶絲中無定形區所占的比例，計算過程簡述如下：

1）若將蠶絲看作只有結晶區和無定形區（即不考慮準結晶區等復雜的情況），記蠶絲絲素中結晶區的積分面積和為SA，無定形區的積分面積和為SB。

2）將Ala在蠶絲結晶區中所占的比例記為a，在無定形區中所占的比例記為b，則應有：

a=SAla Cβ（β）SASA=SAla Cβ（β）a（1）

b=SAla Cβ（α）SBSB=SAla Cβ（α）b（2）

則由式（1）和式（2）可知，無定形區所占的比例記為ηB：

ηB=SBSA+SB=SAla Cβ（α）bSAla Cβ（β）a+SAla Cβ（α）b（4）

3）這里SAla Cβ（α）、SAla Cβ（β）分別為Ala Cβ（α）和Ala Cβ（β）的面積，由分峰擬合得到;a和b的值由韓秀文等[30]、紀濤等[31]的文獻給出。經計算，無定形區含量在桑蠶絲中為57%，在柞蠶絲中為45%，在木薯蠶絲中為43%。

分析可知，木薯蠶絲的無定形區所占比例與柞蠶絲接近，且大于桑蠶絲，這反映木薯蠶絲與柞蠶絲有相似的結晶度，且均大于桑蠶絲。這一結論與楊瑩瑩等[9，13]的研究結果基本一致，但是因計算式中a和b的值是估計值，所以結果是存在誤差的，作為橫向比較是具有參考意義的。

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