診斷超聲波聯合超聲造影劑提高腦腫瘤化療療效的實驗研究

付赤學 鄧勁松 李秋穎

1武警重慶總隊醫院醫學影像科（重慶400061）；2武警廣東省總隊醫院醫學影像科（廣州510507）；3武警吉林省總隊醫院醫學影像科（長春130000）

盡管腫瘤化療藥物不斷推陳出新，但是，近幾年腦腫瘤的化療效果仍然不令人滿意，其原因可能是血腦屏障及血腫瘤屏障（blood?tumor barrier，BTB）影響大分子藥物到達腦腫瘤中的濃度。許多藥物在體外實驗顯示出治療腦腫瘤的巨大潛力，但是由于BTB 的影響，臨床實驗并沒有獲得預期效果。傳統采用滲透性破壞和輻射誘導的方法可以提高BTB 的通透性。但是，這些傳統的方法在促使BTB 通透性增加的同時，非選擇性的增加了血腦屏障的通透性，這既增加了藥物的用量又增加了藥物的毒副作用。有學者用低頻超聲和低功率聚集超聲進行了開放大鼠腦膠質瘤BTB 的研究并取得了一定的效果［1］，但是需要專門的設備。而診斷超聲是否能取得類似的效果以及對于更大動物是否有效未見報道。前期研究發現診斷超聲聯合微泡超聲造影劑能夠選擇性促進血腦屏障的通透性增加［2］，其主要機理與血腦屏障的緊密連接開放有關，BTB 與血腦屏障都具有緊密連接，緊密連接是影響藥物通透性的重要組織結構基礎。因此，本研究利用超聲激發微泡產生的生物學效應，選擇性增加BTB 的通透性，提高腫瘤局部紫杉醇的含量，從而在不增加紫杉醇用量的前提下，提高腦腫瘤的化療效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物20 只新西蘭大白兔，清潔級，由陸軍軍醫大學新橋醫院動物實驗室提供，雌雄不限，體重（2.45±0.23）kg。荷VX2 腫瘤種兔由重慶醫科大學超聲工程研究所提供。

1.1.2 超聲診斷儀兔腦腫瘤超聲二維及造影檢查采用LOGIQ E9，12 L 探頭，頻率7.0 MHz，MI 0.13。腫瘤治療采用Sequoia 512，3V2c 探頭，頻率1.75 MHz，輸出強度MI 1.9，超聲波以間斷觸發方式輻照兔腦，觸發間隔時間為400 ms。

1.1.3 微泡超聲造影劑“脂氟顯”由陸軍軍醫大學新橋醫院全軍超聲中心自制并提供，粒徑范圍為1 ～5 μm，主要為1 ～2 μm，微泡的濃度為（5 ～7）×109mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組將瘤齡14 d 的荷瘤新西蘭大白兔20 只隨機分為4 組，每組5 只。即對照組（記為CON）；單純藥物組（記為PTX）；超聲+藥物組（US+PTX）；超聲+微泡+藥物組（記為US+PTX+MB）。1.2.2 兔腦腫瘤模型參照《兔腦種植VX2 腫瘤動物模型的建立》建立兔腦腫瘤模型。首先，將腫瘤兔用速眠新麻醉，腫瘤及周邊脫毛，常規消毒，取魚肉樣腫瘤組織置于盛有適量生理鹽水的燒杯內，用手術外科剪將腫瘤組織剪成大小約1.5 mm× 1.5 mm × 1.5 mm 的組織顆粒備用。然后，常規麻醉、脫毛、消毒后，在距顱骨矢狀線和冠狀線各1 cm 處鉆孔開顱，去除兔頂骨約2 cm×2 cm，骨蠟止血，于骨窗中央切開硬腦膜，實驗分組與方法：于腦皮質深約2 mm ，植入備用VX2 瘤塊1 枚包埋，明膠海綿少許止血后縫合硬腦膜、頭皮，并再次消毒。肌肉注射適量青霉素，送入動物房，常規喂養14 d，經超聲檢查確認模型成功，備用。

1.2.3 動物模型的評價對瘤齡14 d 的載瘤兔全部施行常規超聲檢查，觀察腦腫瘤的大小、形態、血供等，測量腫瘤的長（L）、寬（D）、高（H），根據公式（L × D × H × ∏/6）計算出腫瘤的體積，記為TV，并進行方差分析，判定治療前各組實驗兔腫瘤組織體積差異是否具有統計學意義。所有實驗兔均進行超聲造影，觀察動脈增強期VX2 兔腦腫瘤是否存在壞死區域，如有腫瘤壞死排除于實驗組。

1.2.4 紫杉醇注射液的制備常溫下將紫杉醇純品溶解于適量的三醋酸甘油酯中，高效液相色譜法檢測紫杉醇溶液的濃度。

1.2.5 治療過程CON 組不進行任何治療；PTX組經兔耳緣靜脈9 min 內勻速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg）；US+PTX 組經兔耳緣靜脈9 min 內勻速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg），同時診斷超聲波輻照兔腦腫瘤10 min；PTX + MB + US 組經兔耳緣靜脈9 min 內勻速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg）及微泡超聲造影劑（0.02 mL/kg），同時用診斷超聲波輻照兔腦腫瘤10 min。總共進行7 次治療，每天一次。最后一次治療完成10 min 后處死實驗兔。完整取出腫瘤組織稱重，取約1/10 腫瘤組織精確稱量、冰凍經高效液相色譜測量各種腫瘤組織中紫杉醇的含量。剩余部分福爾馬林固定，24 h 后石蠟包埋、切片、HE 染色，光學生物顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.2.6 療效評價治療后通過測量各組腫瘤質量（TM）、計算抑瘤率（TIR）以及腫瘤細胞凋亡指數評價療效。腫瘤抑瘤率=（對照組腫瘤平均質量?實驗組腫瘤平均質量）/對照組平均質量×100%。凋亡指數（apoptotic index，AI）的觀察：采用位末端標記（TUNEL）法檢測腫瘤細胞凋亡。光學顯微鏡下觀察染色切片，于400 倍視野下隨機選取5 個腫瘤細胞區，記數細胞總數和凋亡細胞數，計算TUNEL 染色陽性細胞的百分率。AI=（凋亡細胞數/腫瘤細胞總數）×100%。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0 軟件，各組數據采用均數±標準差表示，采用方差分析和獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功建立VX2 腦腫瘤模型超聲檢查發現瘤齡14 d 的VX2 兔腦腫瘤相較于正常腦組織呈均勻高回聲，邊界清晰（圖1A），CDFI：內部未見確認的血流信號（圖1B）。經耳緣靜脈團注0.05 mL/kg超聲造影劑，可見腫瘤區迅速均勻強化，沒有無增強區域（圖1C）。治療前各實驗組腦組織的體積差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 各組腦腫瘤區紫杉醇的濃度US+MB+PTX組腦腫瘤中紫杉醇的含量明顯高于US + PTX 組、PTX 組及CON 組，差異有統計學意義（P< 0.05）。各組腦腫瘤中紫杉醇的含量見圖2。

2.3 各組治療后的質量、抑瘤率治療后US +MB + PTX 組體積明顯小于其他各組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.4 各組經治療后靶區腫瘤細胞凋亡TUNEL法檢測，靶區腫瘤組織凋亡細胞中有棕黃色顆粒，可見腫瘤細胞固縮、核碎裂、固縮、染色質脫落、形成凋亡小體（圖3）。超聲＋載藥微泡組靶區腫瘤細胞凋亡最明顯，其凋亡指數（AI）最高，與其余各組比較差異具有顯著的統計學意義（P< 0.01），見圖4。

圖1 瘤齡14 d 的VX2 兔腦腫瘤Fig.1 VX2 rabbit brain tumor at 14 d

圖2 各處理組腦腫瘤區紫杉醇的濃度Fig.2 Concentrations of paclitaxel in brain tumor areas of each treatment group

圖3 腫瘤細胞凋亡（×400）Fig.3 Apoptosis of tumor cells（×400）

表1 各組治療后的質量、抑瘤率Tab.1 Quality and tumor inhibition rate after treatment in each group ±s

表1 各組治療后的質量、抑瘤率Tab.1 Quality and tumor inhibition rate after treatment in each group ±s

注：US+MB+PTX 腫瘤質量與各組比較#P<0.05，*P<0.01

分組US+MB+PTX US+PTX PTX CON腫瘤質量（mg）516±108.7 697.7±136.2#724.1±131.7*912.0±172.6*抑瘤率（%）34.7±1.4 23.5±1.5 20.6±0.9

圖4 各組經治療后靶區腫瘤細胞凋亡指數（AI）Fig.4 Apoptosis index（AI）of target tumor cells in each group after treatment

3 討論

中樞神經系統腫瘤80%都是轉移性腫瘤，大多發現的時候已是晚期，手術切除的可能性很低，因此化療顯得尤其重要。然而，目前腦腫瘤的化療效果并不令人滿意。盡管一些廣譜抗癌藥如紫杉醇、阿霉素等在顱外腫瘤治療中表現良好［3-4］，但是對腦腫瘤的化療效果不明顯，這可能和BTB阻礙大分子藥物通過有關。為克服BTB 對化療藥物通過的阻礙，國內外專家分別通過細胞旁途徑和跨細胞途徑進行了一系列的探索［5］。經頸動脈灌注高滲溶液和作用于血管的緩激肽增加BTB 的通透性，但是持續時間短，而不斷重復給藥，又會引起顱內壓的增高，甚至破壞腦脊液內環境的穩定［6-7］。有學者嘗試通過影響緊密連接相關蛋白的表達提高緊密連接通透性［8-9］。超聲波輻照組織細胞會產生一定的生物學效應，宋陽等［10-13］研究發現1 MHz，12 mw 的低功率超聲輻照小鼠腫瘤20 s，能抑制caveolin?1 的表達，調高occludin 的表達，跨內皮電阻增高，提示緊密連接的通透性增加，選擇性開放BTB，可持續12 h 之久。也有研究者用低頻低強度聚焦超聲（20 kHz ～1 MHz）進行了類似研究［14-16］，發現低功率聚焦超聲聯合小劑量緩激肽可上調caveolea 結構蛋白caveolin?1 的表達水平，增加吞飲小泡的數量，使緊密連接相關蛋白claudin?5、occludin 和ZO?1 的表達顯著減少，增加BTB 的通透性。超聲對BTB 的影響具有良好的應用前景，但是無論是低功率超聲或是低功率聚焦超聲都需要專門制備相應的設備，不利于推廣應用。因此，本課題在前期研究診斷超聲波能夠促進血腦屏障通透性增加的基礎上，進行了診斷超聲波激發微泡超聲造影劑對BTB 通透性影響的研究。嘗試在不引起廣泛血腦屏障開放的前提下，選擇性地提高大分子藥物紫杉醇跨BTB 轉運水平，以提高腦腫瘤中紫杉醇的濃度。結果發現經超聲激發微泡作用腫瘤組織組，紫杉醇的濃度達到（3.86 ± 0.21）μg/g，較對照組差異具有統計學意義。這可能與以下增強超聲生物效應的措施有關：（1）超聲輻照時間長，達到10 min，超聲與微泡協同的生物效應與超聲輻照時間成正相關。（2）采用間斷觸發（⊿t= 400 ms）的方式輻照腫瘤組織，靶區微泡濃度持續聚集，形成微泡局部高濃度。在一定濃度范圍內，微泡濃度與生物效應成正相關。（3）采用持續靜脈輸注微泡的方式，與傳統團注超聲造影劑比較，肝脾等臟器潴留的微泡數量明顯減少，有利于血池中持續存在一定濃度的微泡，有利于超聲激發微泡持續作用BTB，從而促使BTB 的通透性進一步加大。第四，超聲能量較高，MI 1.9，診斷目的的超聲造影MI 設置為0.15 左右。隨著超聲能量的增加，生物效應更明顯［17］。但是所有這些增強超聲生物效應的措施可能會出現安全性問題，盡管在后續治療中沒有發現腫瘤兔出現即刻的神經癥狀，但是否有輻照區域周圍的腦組織水腫，甚至少量的出血，有待進行更深入的安全性研究。

有關腫瘤組織療效評價，觀察了細胞凋亡情況。凋亡是由相關基因調控完成的一種生理現象，貫穿于機體生長、發育和死亡的整個過程。而腫瘤細胞的一個最顯著的特性就是出現了凋亡功能的失調和無限增殖。近年來選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡也已成為惡性腫瘤生物治療的新策略［18］。實驗中發現通過超聲聯合載紫杉醇微泡靶向釋放于腫瘤組織內，引起靶區腫瘤細胞的凋亡指數明顯高于單純靜脈給藥組及不用紫杉醇治療的空白對照組，促進細胞凋亡作用顯著。前期研究發現診斷超聲輻照超聲造影劑能夠激發微泡的產生空化效應及聲孔效應［19］，促進血腦屏障及BTB的通透性增加，從而提高靶區紫杉醇的含量。而紫杉醇通過促進微管的形成抑制其解聚，影響微管在有絲分裂中的正常功能，包括有絲分裂過程中染色體的移動、細胞形成的調控、激素分泌、細胞膜上受體的固定等。紫杉醇通過促進微管蛋白裝配成微管，然后抑制微管的解聚而穩定微管，從而導致微管的異常排列，形成許多短微管束，這些微管束不與微管組織中心相連，微管彼此呈平行排列，與漿膜平行或垂直，在胞漿中出現許多均勻分布的星絲結構。微管星絲是從一個中心放射發出的，中心內并不含有中心粒，星絲也沒有與染色體連結。微管的異常，使紡錘體失去正常功能，導致細胞死亡。該類藥物可以在缺少鳥苷三磷酸與微管相關蛋白的條件下誘導形成無功能的微管，使微管不能解聚。紫杉醇為細胞周期特異性藥物，主要作用于G2 晚期和M 期，影響細胞有絲分裂，促進腫瘤細胞凋亡。微泡作為一種靶向治療的載體破壞后釋放的藥物能夠進入細胞內、血管壁甚至組織間隙，增強藥物在局部組織的高濃度釋放，由于瘤區局部紫杉醇的含量增高，因此腫瘤細胞凋亡更明顯，從而發揮靶向治療作用［20］。

超聲激發微泡使BTB 通透性增加的機理可能是多方面的。通過前期對大鼠及兔血腦屏障的研究發現，超聲激發微泡能夠產生聲孔效應，空化產生的微射流可能提高血管內皮細胞的通透性，超聲激發微泡產生共振，從而激發空化效應，這可能促使腫瘤血管的緊密連接開放，以細胞旁路方式［21-22］，從而增加紫杉醇進入腫瘤組織的通道，達到提高腫瘤組織中藥物濃度的目的。當然，血腫瘤屏障除了機械屏障而外，還有電化學屏障［23］。因此，是否引起了血腫瘤屏障的電阻抗改變，是否像低頻超聲一樣引起血管內皮細胞的胞飲小體的增加都值得進一步系統研究。

研究表明，診斷超聲聯合微泡組腫瘤的抑瘤率明顯高于對照組，初步顯示了其良好的應用前景，是一種有前途的臨床腫瘤治療技術。隨著各種兼具診斷治療雙重作用的超聲探頭的研制，以及對超聲生物學效應的深入研究，微泡介導腫瘤靶向治療將為臨床腫瘤的治療帶來新的希望。