脈沖電場導致囊泡成孔作用機制的研究進展

石銘蕓，蔣中英

(伊犁師范大學電子與信息工程學院 微納電傳感器技術與仿生器械實驗室，新疆 伊寧 835000)

電場與生物工程相結合可產生高效、有益的現象，例如改變細胞信號轉導、促進傷口愈合和細胞生長、誘導外源分子跨膜輸運等。若將生物細胞或組織暴露于脈沖電場中，可導致細胞膜的結構發生改變，并增強其導電性或滲透性。研究者成功開發了最小細胞膜系統模型——囊泡，該模型可以更好地解釋細胞膜的多種響應機理。目前，對細胞生物學的大部分理解都是基于這一簡單模型的研究[1]。囊泡的大小從幾十納米到幾十微米不等。囊泡由于組分及其溶液環境存在差異而呈現出不同的電特性，因此，在電場中可以對囊泡進行精準控制。囊泡在強脈沖電場作用下，脂質雙分子層形成瞬時孔隙，脂質膜的通透性顯著提高[2]，這種現象被稱為電穿孔或電滲透。作者主要以巨型單層囊泡(giant unilamellar vesicles，GUVs)暴露于脈沖電場為例，簡要介紹電穿孔技術的發展歷程，主要綜述脈沖電場導致囊泡成孔的作用機制，并展望未來的發展趨勢。

1 電穿孔技術的發展歷程

1965年，Coster[3]在進行單細胞的電特性研究時，首次提出穿透效應這一概念。1977年，Zimmermann等[4]發現，巨藻細胞在外加壓力下，臨界擊穿電位會隨外加壓力的增加而相應降低，說明電場作用下的囊泡具有電場擊穿效應[5]。1996年，Weaver等[6]研究發現，當施加電場強度為kV·cm-1量級、持續時間約為微秒至毫秒量級的電脈沖刺激細胞時，脂質雙分子層會出現孔隙，其電導率發生改變[7]。自2012年以來，一些科學家如Lee等[8]、Geng等[9]、Casciola等[10]給出了個案的經驗性指導，包括重要的電場控制參數的設置等。2017年，de Figueiredo等[11]從理論上分析了外部電場對脂質分子和其結構性質的影響。2020年，Karal等[12]討論了膽固醇對GUVs電穿孔的影響。因此，可以認為GUVs的電穿孔行為強烈依賴于脂質分子的結構。

國內關于細胞電穿孔現象的研究也基于細胞模型揭示了脂質膜的多種響應機理，并得出了一般規律。1994年，劉纓等[13]研究表明，電穿孔大小、愈合速率與電脈沖參數有關。2006年，張弘[14]指出，施加的脈沖幅度是影響電穿孔的主要因素。2012年，談亞芳[15]定量分析了腫瘤細胞外膜、內膜電穿孔效應的波形參數條件，得到脂質膜發生電穿孔的電脈沖波形參數閾值條件。2016年，Liu 等[16]研究表明，脂質膜的電透性與囊泡脂質雙層膜的組分直接相關。2017年，Rao等[17]采用微流控電穿孔技術促進紅細胞膜磁性納米粒子的合成。2020年，姚陳果等[18]深入研究了微/納秒脈沖電場誘導電穿孔時細胞物理特性的差異。電穿孔技術在生物醫學領域得到了廣泛的應用，并為癌癥的診斷和治療提供了更具體的數據參考和理論支撐。雖然電穿孔技術應用廣泛，但關于外場作用下的脂質膜形成孔隙和再組裝的動力學過程及調控因素的研究仍較少。因此，深入開展該領域的研究有助于更好地實現電場對生物細胞及組織組裝行為的調控。

2 脈沖電場下囊泡成孔的作用機制

2.1 感應跨膜電壓

脂質雙分子層的兩親性結構使離子無法滲透脂質膜，其疏水層在外電場中呈弱極性。相較于周圍的水溶液，脂質膜可以看作是一層薄的介電層，如果將該模型暴露于強直流電場環境中，可以觀察到電穿孔現象。脈沖電場作用下，囊泡如獨立的球體懸浮在均勻的直流電場中(圖1)。電場驅動內部和外部溶液中的帶電離子，使脂質膜像電容器一樣帶電，通過膜電荷e積累形成感應跨膜電壓Um。根據H.P.Schwan方程[16]，電場強度E增大時，Um隨時間t延長而增加。

Um=1.5ERcosθ(1-e-t/tchg)

(1)

圖1 暴露在電脈沖下的囊泡示意圖Fig.1 Schematic diagram of vesicles exposed to electrical pulse

其中，感應跨膜電壓Um與囊泡半徑R成正比，隨脂質膜上電場方向與指定點法線之間的夾角θ而變化；tchg為電荷在電場作用下脂質雙分子層上累計的時間，它與膜電容Cm和脂質雙分子層內部溶液電導率λi及外部溶液電導率λe有關，可以表示為：

(2)

如果囊泡在電場中脈沖的持續時間長于充電時間，Um達到穩態，即：

Um=1.5ERcosθ

(3)

隨著外加電場強度增大，脂質膜上的膜電壓也隨之增加，當Um=Ucr，囊泡將出現電穿孔現象，此時誘導膜電壓Ucr為跨膜臨界(閾值)電壓。為了確定變形或電穿孔時囊泡上的Um，通常需要使用數值計算。方程式(1)(3)僅適用于球形和未變形的囊泡，只能給出參考值。在實際中，需要考慮多種因素的影響，例如：囊泡大部分是不規則的球形；不同的囊泡其脂質膜組分也不同；不同的培養條件以及不同的溶液成分造成生理環境存在差異，進而對電穿孔有不同程度的影響。

2.2 脂質膜上孔隙的形成

在沒有電場的情況下，脂質膜的穩定性基于兩種相互競爭的能量，即：

E=2πaΓ-πa2τ

(4)

式中：第一項表示切割分子間相互作用所需要的能量以及建立半徑為a的柱形孔隙邊緣所需要的能量，用線張力Γ表示；第二項為在膜張力τ作用下通過釋放孔膜面積所獲得的能量。在這兩種能量的相互作用下產生了孔隙的臨界半徑，脂質膜上的孔隙若超過該臨界半徑，囊泡發生不可逆破裂。

孔隙的形成改變了邊界條件，增強了電場效應，根據Helfrich理論模型，當施加電場后，電場下孔隙的成長方程式[19]為：

(5)

式中：Eproe為影響脂質膜成孔的電場強度；d為膜厚度；ε0為真空介電常數；εW為水的相對介電常數；ε1為脂質相對介電常數；V0為外加電壓。

當跨膜的外加電壓V0增加時，導致Γeff=0或τeff=0(Γeff和τeff為電場加入后的有效值，Γ和τ為理想參數)。當Γeff=0時，V0的增加導致臨界半徑減小并促使囊泡破裂；反之，當τeff=0時，V0的增加使脂質膜上形成穩定的孔隙。電導率導致孔隙周圍的電場線顯著變形；若孔隙半徑a過大，膜厚度d可忽略不計(圖2)。

2.3 脂質膜的不穩定性

囊泡的脂質膜可看作是一個自放電式的電容，在脈沖電場的作用下，脂質膜的充放電時間是非常重要的參數。肖華娟等[5]研究了電穿孔與電脈的關系，結果表明，脂質膜的成孔率隨電場強度、脈沖個數或脈沖寬度的增加而提高(圖3)。Mauroy等[20]

圖2 孔隙形成后脂質膜在外部電場中的示意圖Fig.2 Schematic diagram of lipid membrane after pore formation in external electric field

圖3 脈沖強度(a)、脈沖個數(b)、脈沖寬度(c、d)對脂質膜成孔率的影響Fig.3 Effect of pulse intensity(a),pulse number(b),and pulse width(c,d) on pore formation probability of lipid membrane

沖參數之間也證實了脂質損失是由電場中脈沖的持續時間所控制。Dimova等[21]進一步研究了外加交流電場的頻率和囊泡內、外部水溶液電導率的比值(χ=λi/λe)，發現囊泡可以變形成長橢球體(χ>1)或扁橢球體(χ<1)。通過在交流電場中測量囊泡的電變形，可以得到脂質膜的相關機械性能，如抗彎剛度、電性能和電容等。Riske等[22]利用相差顯微鏡和高速數碼相機研究了GUVs在50～300 μs脈沖下的電變形，發現了類似的GUVs變形對電導率比值χ的依賴關系，并強調了離子在外部溶液中的影響。在無離子存在的情況下，GUVs變形成長橢球體；加入離子后，GUVs瞬間變形成特殊的圓柱形，同樣取決于電導率比值χ(圖4a)。此外，他們通過測定變形的GUVs長寬比a/b來確定變形的程度(圖4c)。結果表明，變形程度隨電場強度的增加或脈沖持續時間的延長而提高，同時也取決于GUVs的初始張力。關于脈沖電場誘導不規則形狀細胞的電穿孔行為，Mescia等[23]又提出了一種數值算法，并根據不同實驗案例分析了電穿孔過程中細胞類型、形狀對電穿孔特性的影響。結果表明，該模型是研究任意形狀細胞電穿孔問題的有效數值工具。值得注意的是，GUVs在電場脈沖過程中的變形是動態的，并取決于脈沖持續時間、電場強度、χ以及外部溶液中存在的離子等。

a.在200 s、2 kV·cm-1的脈沖作用下，χ=1.38、λi=16.5 μs·cm-1、λe=12 μs·cm-1時GUVs呈管狀變形

綜上所述，通過對脈沖反饋信號測量結果的分析可進一步了解脈沖電場與脂質膜相互作用機制，從而更加準確地模擬細胞在脈沖電場作用下的動態行為，為進一步推進脈沖電場的應用提供理論依據，同時也建議通過此反饋信號來建立電穿孔效果實時評估體系。

2.4 脂質膜的組分

囊泡的使用對于控制其脂質膜的組分具有顯著的優勢，改變膜組分可調整膜的流動性和均一性，并獲得特定外場作用下孔隙的尺寸和提高孔隙的穩定性。Dimova等[24]發現，強電脈沖可誘導電中性磷脂酰膽堿(PC)囊泡成孔，并在脈沖結束后該孔隙又重新封閉，其中導致電穿孔的脈沖電壓是跨膜臨界電壓的數倍以上，而負電荷磷脂酰甘油(PG)囊泡則在強脈沖作用下出現破裂、崩解或出芽等現象。Gurtovenko等[25]研究顯示，與1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰膽堿 (POPC)囊泡相比，1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)囊泡雙分子層的臨界電壓更高。分析表明，POPE比POPC的密度更大，阻礙了水分子在雙分子層中的滲透，并減緩了脂質頭部基團進入孔隙的重新定向過程。Riske等[26]研究發現，當PC與PG按1∶1的比例組成的負電荷GUVs暴露在電脈沖下時，可觀察到一種爆破效應(圖5)。

此外，膽固醇的添加也可以降低或提高電穿孔臨界電壓。Mauroy等[27]研究表明，POPC囊泡上膽固醇濃度的增大會導致臨界電壓升高，而該膽固醇對PC囊泡的臨界電壓沒有顯著影響。Karal等[12]研究發現，隨著二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)和膽固醇混合GUVs膜中膽固醇濃度的增大，在外加電場作用下脂質膜的成孔率和成孔速率常數降低(圖6)。表明在電場作用下，GUVs膜的線張力隨膽固醇濃度增大而增大，是造成成孔速率常數減小的主要原因。總的來說，膽固醇對脂質雙分子層的影響是不同的，并且強烈依賴于脂質分子的結構。因此，可以根據不同脂質膜組分優化其電化學參數，這對細胞的生物學意義也有著重要的影響[28]。

a.脈沖參數：1.4 kV·cm-1,tpulse=200 μs

3 結語

目前，電穿孔技術已廣泛應用于生物技術、生物醫學及遺傳工程等多個領域，在電脈沖結合抗癌藥物加速腫瘤細胞消亡的研究、遺傳物質的電轉染技術、非熱效應殺菌、經皮給藥[29]、抑制基因表達等方面都具有巨大的潛在應用價值。但是電穿孔技術在應用中對部分細胞特性的分析并不是十分完善，特別是在如何由更復雜的GUVs系統來闡明活細胞膜成孔時的作用機制等方面仍然面臨很大的挑戰。

圖6 單個GUVs的孔隙形成的熒光圖像(a)、GUVs的隨機孔隙形成時間(b)、不同膽固醇(chol)組分GUVs的線張力(Γ)與GUVs在時長60 s內成孔率(Ppore)的關系(c)、添加15%膽固醇的GUVs在Γ為7 mN·m-1、8 mN·m-1和9 mN·m-1時的時間歷程(d)Fig.6 Fluorescence images of pore formation of single GUVs(a),random pore formation time of GUVs(b),relationship between thread tension(Γ) of GUVs with different cholesterol components and pore formation probability(Ppore) of GUVs in 60 s(c),and time course of GUVs with 15% cholesterol at Γ=7 mN·m-1,8 mN·m-1，and 9 mN·m-1(d)

今后，脂質膜成孔級聯過程重新打開孔隙的所需時間與一般脂質膜系統所需時間的數量級比較及原因探究，將是未來的努力研究方向；膜蛋白在受到電場作用時，影響細胞膜通透性改變的成因分析也將是未來的研究重點。展望未來，還將開辟一個領域，即利用電場作為一種非接觸式診斷工具來測量細胞機械性能的變化，并區分與疾病進展相關的重要生物學因素(如病理、遺傳和表觀遺傳等)。