食源性鈣螯合肽的研究概況

胡冠華,王德寶,蘇琳,趙麗華,田建軍,張忠海,朱浩田,靳燁*

1(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院,內蒙古 呼和浩特,010018) 2(內蒙古澳菲利食品股份有限公司,內蒙古 巴彥淖爾,015000)

食源性功能肽是指生物體從外界攝入的活性肽,以特定的氨基酸序列存在于膳食蛋白質中,蛋白質在降解過程中釋放出具有生理活性的功能肽[1]。鈣是人體中必不可少的礦物質元素,具有多種重要的生理功能。鈣不足容易導致佝僂病、骨質疏松、高血壓等疾病[2]。飲食攝入是人體骨骼補充鈣的唯一來源,而鈣的吸收受膳食中的植酸鹽、草酸鹽以及其他陽離子如鋅離子、鎂離子和鐵離子的影響[3]。目前市面上的補鈣產品多為離子鈣,例如碳酸鈣、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣,在腸道環境中易形成沉淀,嚴重降低了人體對鈣的吸收[4]。螯合鈣因其吸收性好、生物利用度高,被認為是離子鈣的替代品[5],在小腸內按照肽的吸收原理進行吸收,能夠有效促進人體對鈣的吸收[6]。

鈣螯合肽被認為是改善鈣生物利用度的新型功能性成分,到目前為止,已有大量的鈣結合肽從各種食品資源中分離出來,如魚骨[7]、乳清[8]、大豆[9]等。酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPPs)是研究最多的促鈣吸收肽,通過絲氨酸的磷酸殘基與鈣螯合形成可溶性的穩定復合物,增加腸道對鈣的吸收[10]。本文綜述了近年來國內外報道的鈣螯合肽的制備、分離純化、結構分析及生物活性等內容,以期為我國功能肽的利用和開發提供參考。

1 鈣螯合肽的制備

1.1 蛋白質降解

蛋白質的氨基酸序列和空間結構賦予其獨特的功能,為了將蛋白質降解為肽類和氨基酸,需要采用各種理化手段,打破蛋白質的多級結構[11]。酶解法因其條件溫和、反應專一、安全環保等特點,廣泛應用于活性生物肽的制備。

蛋白酶具有特定的酶切位點,不同蛋白酶可制備不同分子質量和生物活性的肽。一般酶解反應在蛋白酶最適條件下進行,以獲取最佳的酶解效果。劉靜[12]分別選用5種蛋白酶酶解牦牛骨粉,篩選出堿性蛋白酶為最優蛋白酶,當底物質量分數為3.5%,溶液pH 7.0,酶解溫度50 ℃,酶底比4 000 U/g,酶解4 h,此時多肽得率為22.06%。由于蛋白酶的作用位點、活性部位及化學性質相差較大,為了得到生物活性更高的蛋白肽,也有研究采用復合酶、雙酶水解方式。魏新穎[13]將木瓜蛋白酶和風味蛋白酶進行復配酶解雞肉蛋白制備鈣螯合肽,發現雙酶分步酶解所得產物的鈣螯合能力大于雙酶同步酶解，并通過響應面實驗設計優化,得到最佳酶解工藝：木瓜蛋白酶添加量0.3%,酶解3.5 h,風味蛋白酶添加量0.18%,酶解2.84 h,酶解產物鈣螯合力為(61.64±1.04) mg/g(pro)。WU等[14]采用不同的酶解方式(單酶、雙酶分步、雙酶同步)酶解豬骨膠原蛋白,發現底物質量分數為8%,pH 9.0,50 ℃下水解4 h,酶用量為8 000 U/g(堿性與中性按1∶1同時添加),水解度顯著高于其他水解方式。以上結果表明,多種蛋白酶協同作用可增加蛋白的酶解效果。還有研究報道,在高壓脈沖、超聲波、微波等現代技術輔助下蛋白質的水解效果會大大提高。王靜雅等[15]在高壓脈沖電壓輔助下酶解河蚌肉,與單酶解相比水解度提高18.0%。DONG等[16]利用熱壓法輔助酶法提取雞骨中的蛋白,先在(130±0.5) ℃下加熱120 min,后風味蛋白酶酶解,發現水解效果顯著高于單純酶解。

蛋白質的水解程度受原料、蛋白酶、酶解條件等因素的影響較大,有必要針對不同底物確定最佳蛋白酶酶解工藝,以便在現代技術的輔助下高效制備生物活性產品。

1.2 分離純化及結構鑒定

由于酶解過程的連續性和蛋白酶的非專一性,酶解產物組成復雜,需通過分離純化技術制備具有特定分子質量區間以及功能活性的多肽組分。為得到純度更高的螯合肽,通常將多種分離純化技術聯合使用。以具有特定截留分子質量的超濾膜、固定化金屬離子親和層析法(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)和羥基磷灰石色譜(hydroxyapatite chromatography,HAC)作為第一步將酶解產物進行粗分,然后利用葡聚糖凝膠色譜柱或離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)進一步分離,最后采用反相高效液相色譜(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)得到純度和活性較高的組分。ZHANG等[17]通過HAC和RP-HPLC對太平洋鱈魚骨的酶解物進行分離,得到一種新的十肽,鑒定為KGDPGLSPGK(命名為Peptide-K,分子質量：954.5 Da),其表現出高的鈣結合活性(2.53±0.12) mg/g(pro)。CAI等[18]利用凝膠過濾色譜和RP-HPLC,從裂殖壺菌屬中分離純化出一種具有特定鈣結合能力的新型肽(Phe-Tyr),此肽的鈣結合能力達到128.77 mg/g(pro)。酶解產物經分離純化得到單一組分后,可以通過飛行時間質譜(time-of-flight mass spectrometer,TOF-MS)分析其氨基酸序列和分子質量。ZHAO等[8]利用陰離子交換色譜,Sephadex G-25凝膠過濾和RP-HPLC從乳清蛋白水解物中獲得了一種分子質量為237.99 Da的鈣結合肽,通過TOF-MS確定其氨基酸序列為Gly-Tyr,鈣結合能力為75.38 mg/g(pro),與乳清蛋白水解產物復合物相比提高了122%。CHEN等[19]采用酶解和膜分離法制備鈣結合肽,經過Sephadex G-15凝膠色譜和RP-HPLC分離純化,得到一種具有較高的鈣結合活性的肽(76.8±4.5 mg/g(pro)),通過TOF-MS分析確定其氨基酸序列為Glu-Pro-Ala-His,分子質量為453.3 Da?？傊?有多種選擇可用于分離純化肽,但存在用時過長、效率較低等問題。從工業角度出發,需要開發更加高效的技術,大規模開發和制備附加值產品。

2 鈣螯合肽的結構特征

目前,紅外光譜和核磁共振等已被廣泛的用于研究螯合物的化學鍵、結合位點、組成等問題。雖然鈣螯合肽的構效關系尚未完全建立,但已經確定了一些可能影響螯合活性的結構特征,包括肽的分子質量、氨基酸組成及序列和特定的氨基酸基團。

2.1 分子質量

蛋白質的水解產物通常為不同分子質量產物的混合物。研究顯示,肽的螯合能力與分子質量大小具有一定的相關性,大多數情況下,分子質量越小的螯合肽活性越強。分子質量大的肽其內部活性基團與螯合位點無法最大程度的暴露,與鈣離子的接觸機率低,螯合能力較低。TAM等[20]首次從日本青蟹蛋白酶解物中鑒定出一種分子質量為948.4 Da的新型鈣結合肽,對比10 k～30 kDa,3～10 kDa,1～3 kDa和<1 kDa的4個肽段的鈣結合活性,發現<1 kDa的肽段鈣親和力最高為(277.96±20.93) mg/g(pro)。劉麗莉[21]利用超濾膜將發酵液逐步分離,發現不同分子質量肽螯合鈣的能力相差很多,10 kDa以上肽段螯合能力較低,2～4 kDa 肽段的螯合率最高達41.23%。李超楠[22]以米蛋白為原料,研究不同分子質量的多肽(未分級肽段、<3 kDa、3 k～5 kDa、5 k～10 kDa 和 >10 kDa)對鈣螯合能力的影響,結果表明3 k～5 kDa肽段螯合能力最強。BUDSEEKOAD等[23]利用超濾法將綠豆蛋白水解物分離為8個組分,測定鈣的結合性能,發現<5 kDa的肽鈣結合活性最強。但是也有研究顯示,高分子質量的鈣結合肽同樣具有較強的活性。LV等[24]研究大豆促鈣吸收肽對鈣的吸收作用時表明,分子質量為10～30 kDa的肽比 3～10 kDa及 1～10 kDa的肽結合活性更強。

上述研究結果所存在的差異,可能是多方面原因導致：(1)蛋白來源、組成結構不同所致；(2)評估肽段大小的方法不同；(3)分離純化方法的不同。因此有待進一步深入探索關于不同分子質量對螯合活性的影響。

2.2 氨基酸組成及序列

除了分子質量外,多肽的氨基酸組成及序列也對鈣螯合能力起著重要的作用。研究表明,某些螯合活性好的促鈣吸收肽中通常存在半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)。CHEN等[25]從羅非魚魚鱗的酶解液中分離出一種高鈣螯合肽,并通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定出該肽的序列為 Asp-Gly-Asp-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Lys-Ile-Gly,Asp、Gly 和 Glu 這3種氨基酸殘基在該多肽的含量最高,其中Asp和Glu存在，會為鈣離子提供有力的配位環境。同時LIU等[26]采用雙酶復合工藝對大西洋鮭魚骨頭進行酶解,利用RP-HPLC對肽螯合鈣進行分離純化,通過四極桿飛行時間質譜確定其分子質量及氨基酸序列,發現魚骨中鑒定出的22種肽中有17種肽具有Glu和Asp殘基,推測Glu和Asp殘基可能對鈣螯合肽的結合活性起作用。另外,在沒有Glu和Asp殘基的5種肽中,有4個肽具有Ser或Thr殘基,所以認為Ser、Thr同樣對鈣離子的螯合活性貢獻較大。這與JUNG等[27]和KIM等[28]報道一致,認為Ser、Thr、Met和Tyr可能有助于鈣結合。此外,據報道,含有組氨酸(His)殘基的肽對鈣離子也具有高親和力。HUANG等[29]從蝦加工副產物中分離出了一種含有組氨酸的三肽Thr-Cys-His,具有高鈣結合能力,推斷可能是His殘基存在的原因。

2.3 特定基團和殘基

通過對比多肽與鈣螯合前后的光譜圖變化,可以證明螯合物的產生、解決螯合物的化學鍵問題,分析其反應基團,對多肽螯合鈣結構鑒定和螯合機制的研究具有重要意義。研究發現,鈣螯合肽可以通過特定的氨基酸基團和殘基,如羧基、羰基、氨基、亞氨基和含硫巰基參與配位反應。ZHANG等[30]采用胰蛋白酶和中性蛋白酶從太平洋鱈魚骨中制備鈣結合肽(CBP),經紫外光譜和傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)顯示,CBP通過羧基和氨基與Ca2+結合,形成肽鈣復合物。HOU等[31]用胰蛋白酶對南極磷蝦水解,產物經HAC、RP-HPLC分離純化、TOF-MS確定其氨基酸序列為VLGYIQIR,分子質量為960.58 Da,并根據FTIR結果推測,鈣離子的螯合位點可能涉及Gln、Ile和Arg殘基的羰基。WANG等[32]報道小麥胚芽蛋白水解物中的鈣螯合肽,通過FTIR,X射線衍射和核磁共振波譜研究肽鈣的螯合機理,結果顯示羧基的氧原子與酰胺基的氮原子提供主要的結合位點。CUI等[33]通過肽組學鑒定了海參卵中新型七肽鈣(NDEELNK)復合物的鈣結合模式,發現NDEELNK肽以1∶1的化學計量比自發地結合鈣,并且位點可能涉及NDEELNK肽中2個Glu和1個Asp殘基的羧基氧和氨基氮原子。SUN等[34]通過蛋白的結構和熱力學特性,闡明了蛋清水解產物五肽(DHTKE)與鈣離子之間的結合方式,DHTKE肽以1∶1的化學計量比自發地結合鈣,且位點對應于肽的羧基氧,氨基氮和咪唑氮原子。

此外還發現螯合反應與蛋白質的磷酸化位點有關。CPPs中的磷酸化絲氨酸殘基能夠與鈣離子結合形成可溶性復合物,將鈣包裹其中避免鈣在人體腸道內形成沉淀,有效提高鈣的吸收利用率。且磷酸絲氨酸殘基的數量和位置對于結合活性有重要作用。SATO等[35]發現磷酸化絲氨酸基團與鈣螯合肽的結合成正相關,并證明了酪蛋白分子的磷酸鹽部分對增強人體小腸吸收鈣離子是非常必要的。ZONG等[36]研究磷酸絲氨酸的位置對于鈣結合的重要性,研究表明含有3個Ser的磷酸肽結合鈣能力最強,有效抑制磷酸鈣沉淀,磷酸肽中的不連續Ser結合鈣能力弱,更容易釋放鈣。雖然已經報道了一些特定的基團是螯合物形成的必須形式,但仍需要進一步研究鈣螯合肽的螯合機理,包括肽鏈上螯合位點的位置、分子結構和動態過程。

3 鈣螯合肽的生理活性

3.1 促進鈣元素生物利用度

肽鈣螯合物具有良好的溶解度、吸收性和穩定性,在胃腸道的弱堿性環境中能夠有效地運輸鈣離子通過腸上皮細胞,被機體吸收和利用。CHEN等[37]研究鱈魚皮源螯合肽在體外胃腸道消化過程中的穩定性,發現只有少量肽發生降解,約75%的肽表現出良好的穩定性。GAO等[38]研究CPP和可溶性膳食纖維模擬胃腸道中的理化性質,結果表明該共聚物的最大鈣結合水平達到了46.8%,比原來的CPP高35.17%。

目前,評價肽鈣螯合物生物利用度的方法主要有體外細胞模型(Caco-2、HT-29 細胞模型)和體內動物試驗。Caco-2 細胞來自人體結腸癌細胞株,在體外培養時自動分化形成類似于人體小腸上皮細胞的結構特征,且與小腸上皮細胞具有相似的轉運系統和標志酶的功能表達。CAI等[1]從海洋微生物中分離得到一種肽YL,利用Caco-2細胞體外促鈣吸收轉運顯示YL-Ca具有良好的熱穩定性和溶解性,與氯化鈣相比可將鈣在 Caco-2 細胞中的吸收率提高3倍,并保護鈣離子免受營養抑制劑如單寧酸、草酸鹽、植酸鹽等影響。SUN等[34]使用Caco-2細胞研究蛋清肽鈣復合物的體外吸收,結果表明與不含鈣的對照相比,肽鈣復合物可使跨Caco-2細胞單層的鈣吸收提高7倍以上。這些結果證明鈣螯合肽在促鈣吸收轉運過程中起重要作用。HT-29細胞系由于具有不同細胞分化模式的能力而常被用于研究鈣的體外吸收模型。COSENTINO等[39]證明CPPs能通過增加HT-29細胞中的鈣濃度來改善鈣的吸收。

動物模型被廣泛用于體內生物利用度研究,據報道鈣螯合肽能促進鈣吸收,增加骨礦物質密度和強度,降低骨質疏松癥的風險。HUA等[40]研究小球藻蛋白肽鈣螯合物對低鈣飲食喂養大鼠鈣吸收代謝的影響,發現肽鈣螯合物能顯著增加大鼠體重,提高大鼠血清鈣、骨礦物質密度和骨礦物質含量的水平,降低血清堿性磷酸酶,并抑制骨骼的形態變化。ZHANG等[7]通過建立去卵巢大鼠骨質疏松模型來驗證,太平洋鱈魚骨制備的鈣結合肽具有抗骨質疏松的生物活性,結果表明該螯合肽可以提高鈣的生物利用度和血清鈣,降低骨轉換率,從而改善骨質疏松癥。QU等[41]研究烏耳蛋白水解產物肽鈣復合物對治療廢用性骨質疏松癥的保護作用,結果表明木耳肽鈣復合物有助于改善小鼠的骨礦物質密度,骨礦物質和有機物含量,并有效減輕與骨有關酶的改變代謝,以避免更嚴重的骨質流失。

3.2 抑菌抗氧化活性

肽鈣螯合物不僅可以促進機體對鈣元素的生物利用度,還具有抗氧化、抑菌等生物活性作用。王夢婭等[42]利用復合酶解法得到大竹蟶源鈣螯合肽,通過硫代巴比妥酸和抑菌圈試驗結果表明鈣螯合肽有良好的抗氧化活性和抑菌活性。蒲傳奮等[43]探究玉米醇溶蛋白肽制備的多肽螯合鈣的抗氧化和抗菌活性,結果表明肽鈣螯合物的 DPPH自由基清除率為85.6%,相當于α-生育酚的89.53%,能有效地抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,說明此肽鈣螯合物具有一定的抗氧化和抑菌活性。丁利君等[44]利用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶酶解羅非魚,將多肽酶解液與氯化鈣進行螯合,實驗結果發現該螯合物對多種微生物,如腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、熒光假單胞菌、啤酒酵母、白色念珠菌、黑曲霉等都有一定的抑制作用,特別是對細菌的生長抑制效果更加明顯。鈣螯合肽的抗氧化活性是由于其能夠螯合鈣離子從而阻止自由基的生成,還與其自身的一些活性基團有關,如酪氨酸、組氨酸和半胱氨酸的吲哚基、咪唑基和巰基,這些基團在肽的抗氧化中起到重要作用。

4 結語

食源性的鈣螯合肽營養價值高、吸收性好,不僅可以解決鈣元素在人體內吸收差和生物活性低的問題,同時也具有抗氧化、抑菌、免疫調節等生理作用,可用作醫藥產品和保健食品的開發等,也可以用于抗氧化劑、抑菌劑、食品添加劑、有機肥料、動物飼料等產品的工業化生產,具有很高的應用價值和開發前景。但目前的研究尚存在一些問題,例如：(1)對其安全性評價的研究較少,目前只是在體外模擬或小鼠實驗,有必要在有缺鈣風險的人群中對肽鈣螯合物及其作為鈣補充劑的應用進行進一步研究；(2)肽鈣螯合物的構效關系和活性機制不完全明確；(3)游離態的礦質元素和螯合態的礦質元素很難準確分離；(4)螯合物的高效分離與純化技術還有待提高；(5)生物活性的進一步挖掘與研究等問題還有待解決。上述諸多方面問題應得到各方的聯合關注,以期為相關副產物的研究開發提供科技理論支撐。