長鏈非編碼RNA loc728196促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生的調(diào)控機(jī)制

王歐洋

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于中樞神經(jīng)體系，發(fā)病率高，占原發(fā)性腦腫瘤35.26%～60.96%［1］，病理上多呈浸潤性生長，手術(shù)難度大，較難分辨出真正的腫瘤邊界，放療輻射耐受程度可能會引起殘余病灶復(fù)發(fā)。長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度＞200核苷酸的RNA，本身無蛋白質(zhì)編碼能力，近年來國內(nèi)外研究表明，lncRNA參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)，已有研究表明lncRNA在膠質(zhì)瘤中存在異常表達(dá)［2］；lncRNA UCA1促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長，且可通過靶向miR-122發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。lncRNA CCAT1在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)抑制miR-410，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。lncRNA SNHG1通過調(diào)節(jié)、遷移和凋亡促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展，可評估預(yù)后程度［4］。lncRNA TP73-AS1與miR-142相互作用，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。loc728196是一種新型lncRNA，但目前國內(nèi)外尚無關(guān)于lncRNA loc728196與人腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)性研究。因此，本研究將實(shí)驗(yàn)證明lncRNA loc728196/miR-513c軸通過靶向TCF7促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形膠質(zhì)細(xì)胞系（NHA）購自美國ATCC（American Type Culture Collection）。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，且在37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 小干擾RNA（si-LOC728196；5"-G AGACU AUAUUGUUAGUAAUA-3"）和短發(fā)夾狀RNA （shRNA；5"-GAGACTATATTGTTAGTAATA-3"）由Invitrogen合成純化。MiR-513c模擬物（5"-UUCUCAAGGAGGUGUCGUUUAU-3"），MiR-513c抑制劑（5"-AUAAACGACACCUCCUUGAGAA-3"）和陰性對照組（miR-NC；5"-UCACAACCUCCUAGAAA GAGUAGA-3"）均購于 GenePharma公司（Shanghai，China）。參照轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 的 說 明 書 步 驟， 將100nM siRNAs、miRNAs轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中。在病毒生產(chǎn)方面，將sh-LOC728196序列克隆到pHBLV-U6慢病毒核心載體中（Hanbio，Shanghai，China）。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 2×103U251和A172細(xì)胞置于96孔板中培養(yǎng)24h、48h或72h。然后將CCK-8溶液（Beyotime，Shanghai，China） 加 入 細(xì) 胞 4h， 然后CCK-8法450nm波長處測定每組細(xì)胞吸光度值。1×103U251和A172細(xì)胞接種至6孔板的每一口中，孵育14d后，菌落用甲醛固定，用0.5%結(jié)晶紫（Sigma，USA）染色，然后用顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞組常規(guī)消化后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基制備1×108/L的細(xì)胞懸液。于24孔板Transwell小室上室中加入200μl細(xì)胞懸液，下室中加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48h后，取出小室，分別加入10%甲醇和0.1%結(jié)晶紫溶液固定、染色，晾干后，于倒置顯微鏡下觀察、拍照。各組細(xì)胞遷移能力以隨機(jī)選取的6個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)的平均值表示。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前，以濃度為1g/L的Matrigel對Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜進(jìn)行包被，于培養(yǎng)箱內(nèi)聚合反應(yīng)30min后，在小室上室中加入細(xì)胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，取出小室，以甲醇和結(jié)晶紫對細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，倒置顯微鏡下拍照分析。詳細(xì)步驟參照遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5 qRT-PCR法 檢 測lncRNA-LOC728196、MiR-513c及TCF-mRNA表達(dá) 按照Trizol試劑盒步驟提取組織總RNA，以β-actin為內(nèi)參，qRT-PCR按照SYBR-Green試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)體系的配置，通過PrimeScriptTMRT試劑盒檢測RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物稀釋后，加相應(yīng)RNA的引物，用SYBR Green Kit法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)。

1.6 Western-blot法檢測TCF7蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48h后的各組細(xì)胞，加蛋白酶抑制劑裂解，4℃以下以12000r/min離心30min，取上清液，根據(jù)BCA蛋白定量檢測試劑盒操作要求測定總蛋白濃度。各組加入12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜；含5%脫脂牛奶的封閉液室溫下封閉1h，轉(zhuǎn)膜，加一抗，4℃過夜，加入二抗，室溫下孵育30min；洗模后顯影曝光。使用GAPDH為內(nèi)參，ImageJ分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lnc RNA -loc728196在膠質(zhì)瘤組織中存在高表達(dá) 實(shí)驗(yàn)比較四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形膠質(zhì)細(xì)胞系（NHA）中l(wèi)ncRNA-loc728196基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-loc728196表達(dá)水平顯著高于正常膠質(zhì)細(xì)胞系（見圖1）。結(jié)果表明lncRNA-loc728196與膠質(zhì)瘤疾病的發(fā)生有密切相關(guān)性。

圖1 四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87、U251、LN229和A172）和NHA中l(wèi)ncRNA- loc728196基因表達(dá)比較（?P＜0.05，??P＜0.01）

2.2 loc728196影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 對于loc728196的功能研究，作者進(jìn)行了細(xì)胞增殖、遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，首先設(shè)計(jì)了兩個(gè)針對loc728196抑制其表達(dá)的siRNA序列。qRT-PCR分析顯示，轉(zhuǎn)染兩種siRNA均可顯著抑制U251和A172細(xì)胞中l(wèi)oc728196的表達(dá)（見圖 2A）。然后，利用siRNA #1進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。CCK8結(jié)果表明，沉默loc728196可降低U251和A172細(xì)胞的增殖率（見圖2B、C）。此外，克隆形成實(shí)驗(yàn)還顯示，沉默loc728196可減少克隆數(shù)（見圖2D），表明loc728196能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，沉默loc728196可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（見圖2E、F）。

圖2 U251、A172細(xì)胞株轉(zhuǎn)染不同干擾質(zhì)粒后loc728196基因表達(dá)及細(xì)胞功能變化（?P＜ 0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）

2.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)oc728196與 miR-513c的相互調(diào)節(jié)作用 在前期的生物信息學(xué)分析中，發(fā)現(xiàn)loc728196與miR-513c之間存在2個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)（見圖3A）。基于此，作者在細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-513c模擬劑，結(jié)果顯示loc728196-WT#1和loc728196-WT#2的熒光素酶活性均被明顯抑制（見圖3B），表明轉(zhuǎn)染miR-513c可抑制loc728196表達(dá)水平。為了更進(jìn)一步證明loc728196和miR-513c之間的調(diào)節(jié)關(guān)系，U251和A172細(xì)胞系通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染敲除loc728196，發(fā)現(xiàn)miR-513c表達(dá)水平較前提高（見圖3C）；在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-513c后，loc728196表達(dá)水平下降（見圖3D）。

2.4 LOC728196通過miR-513c調(diào)控TCF7表達(dá) 前期生物信息學(xué)分析中，作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-513c與TCF7 mRNA結(jié)合的2個(gè)潛在位點(diǎn)（見圖4A）。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了miR-513c可結(jié)合在 TCF7 mRNA的3 "-UTR區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn)（見圖4B）。U251和A172細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-513c后，TCF7蛋白水平和mRNA水平均下降（見圖4C、D）；同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-513c和loc728196-WT的細(xì)胞組TCF7 mRNA水平較轉(zhuǎn)染miR-513c細(xì)胞組明顯升高（見圖4F）。在U251和A172細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-loc728196，TCF7 mRNA水平下降；而同時(shí)轉(zhuǎn)染si-loc728196和miR-513c抑制劑的細(xì)胞組TCF7 mRNA水平明顯高于僅轉(zhuǎn)染si-loc728196細(xì)胞組（見圖4E）。以上結(jié)果表明loc728196可通過抑制miR-513c發(fā)揮促進(jìn)TCF7表達(dá)的作用。

圖3 loc728196與miR-513c的熒光素酶活性結(jié)果及miR-513c對loc728196的負(fù)調(diào)控作用（?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）

圖4 TCF7與miR-513c的熒光素酶活性結(jié)果及miR-513c、loc728196對TCF7的調(diào)節(jié)作用（?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）

3 討論

lncRNA很多功能尚未完全明確［5］，但隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明lncRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)，參與多方面的細(xì)胞生物功能，包括轉(zhuǎn)錄的激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等［6］。lnc RNA很可能影響促癌基因或抑癌基因的功能，從而促進(jìn)或者抑制腫瘤的形成［7］。近年來國內(nèi)外研究表明，lncRNA HNRNPKP2在胃癌中表達(dá)上調(diào)，其通過CXCR4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［8］；也有研究表明，lncRNA SNHG1作為一種ce RNA 抑制miR-199a-3p活性，刺激CDK7的表達(dá)，因此促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的發(fā)展［9］；此外，lncRNA MALAT1通過調(diào)節(jié)miR-125b在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮癌基因的作用［10］；lncRNA HOXD-AS1通過作為 ceRNA 上調(diào) SOX4水平促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。不僅如此，現(xiàn)有研究表明越來越多l(xiāng)ncRNA參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)，國內(nèi)外研究也證明lncRNA在膠質(zhì)瘤中存在異常表達(dá)［11］。已有研究表明，lncRNA UCA1促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長，且可通過靶向 miR-122發(fā)生轉(zhuǎn)移［12］；lncRNA CCAT1在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)抑制miR-410，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［13］；lncRNA SNHG1通過調(diào)節(jié)、遷移和凋亡促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展，可評估預(yù)后程度［14］；lncRNA TP73-AS1與miR-142相互作用，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［15］；lncRNA MALAT1可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的耐藥性［16］。此外，lncRNA CRNDE 可作為評估膠質(zhì)瘤預(yù)后的生物標(biāo)記物［17］。以上諸多研究均表明lncRNA可能在膠質(zhì)瘤生長及凋亡等過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究表明沉默loc728196可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，提示lncRNA loc728196可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和凋亡密切相關(guān)；同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)loc728196可能作為一個(gè)ceRNA 調(diào)節(jié)miR-513c的表達(dá)，而TCF7可能是miR-513c的直接靶標(biāo)，且loc728196和miR-513c之間存在相互抑制關(guān)系，loc728196通過調(diào)節(jié)miR-513c促進(jìn)TCF7表達(dá)，因此，作者推測lncRNA loc728196可能通過miR-513c/TCF7途徑來參與對膠質(zhì)瘤的生長及凋亡的調(diào)控。本研究通過研究膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)的分子生物學(xué)靶點(diǎn)，尋求一種新的生物學(xué)標(biāo)志物，及早發(fā)現(xiàn)及阻斷膠質(zhì)瘤的生長和增殖，從新的角度揭示lncRNA loc728196可能通過miR-513c/TCF7途徑調(diào)控膠質(zhì)瘤的生長及凋亡，為膠質(zhì)瘤患者的治療及預(yù)后評估提供了新的治療靶點(diǎn)。