有機磷阻燃劑TDMPP 對斑馬魚早期器官發育毒性的研究

宋唯一 劉景 白瓊瓊 武希玲 張金鵬 殷德輝

阻燃劑(flame retardant,FR)是一類賦予易燃聚合物難燃性的功能化合物,廣泛應用于多種行業,如塑料、粘合劑、橡膠和染料等。阻燃劑在自然環境中易殘留,且能在生物體內蓄積,尤其是脂肪組織,因此,阻燃劑對人群的毒理學影響以及潛在的生態風險已經引起國際 公共衛生領域學者的廣泛關注［1］。目前已有研究表明,用于阻燃的化學品,如多溴化,二苯醚(BDEs)可損害大腦發育,導致內分泌紊亂,干擾生殖功能和導致患癌風險等［2,3］。因此,許多國家/地區嚴格規范了某些五溴二苯醚和八溴二苯醚技術配方的使用,例如 BDE-99、BDE-47 和BDE-183。十溴二苯醚最近被《斯德哥爾摩公約》列為持久性有機污染物 POPs［4］。除溴系阻燃劑外,磷酸鹽阻燃劑同樣應用廣泛。目前市面已經開發出多種商用低聚有機磷阻燃劑替代多溴二苯醚等傳統的溴系阻燃劑［5］,TDMPP 近年被確定為是PBDMPP 阻燃劑配方中的雜質［6］。體外研究表明,TDMPP 能夠激活雌激素受體(ERα),其效力為雌二醇(E2)的 1/10000,具備干擾內分泌系統的潛力［7］。然而對磷酸鹽阻燃劑體內毒理影響的評估尚不完善,關于TDMPP 的系統性毒理學評價尚未見報道。本研究中,應用多種斑馬魚轉基因品系,對新型的有機磷阻燃劑TDMPP 進行系統性毒理學評價,包括急性毒性、發育毒性和器官毒性等,從而為TDMPP 的市場應用和危險度評估提供證據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 TDMPP、MS-222、甲基纖維素、亞甲基藍等均購于美國Sigma 公司。尼康熒光體式顯微鏡Nikon SMZ18,Digit Sight DS-Fi2。上海海圣斑馬魚養殖系統,Z-A-D5,交配盒。培養箱,HPX-9052MBE。水浴鍋,金壇良友HH-3A。

1.2 斑馬魚品系及養殖 肝胰臟雙標記斑馬魚品系Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)購于國家斑馬魚中心。采用全套斑馬魚自動化養殖系統,水溫 28℃,pH=(7.3±0.2),電導率500～550 μS/cm,氧飽和度≥80%。喂食豐年蟲2 次/d。所以實驗步驟嚴格遵守徐州醫科大學動物倫理委員會的相關規定。

1.3 TDMPP 暴露實驗 將50 mM TDMPP 儲液用系統水倍比稀釋至0～2000 μM。以6 孔板為容器,隨機選取270 顆2 h pf 的肝臟胰腺雙標記轉基因斑馬魚胚胎于6 孔板中,將2 h pf 受精卵隨機分為處理組和對照組,每孔30 顆受精卵,每組2 個復孔,確保各組乙醇濃度均＜0.01%,連續暴露至72 h pf。72 h 后,將幼魚麻醉后(0.03% MS-222),在熒光體視鏡下觀察各組幼魚肝臟及胰腺的發育形態并拍照。隨后,統計各組幼魚存活率,應用 SPSS 軟件計算半數致死量(LC50)。根據LC50,選取 10 μM 和 100 μM 分別作為低濃度組和高濃度組進行后續研究。相同的處理方式,72 h 后進一步觀察各組中幼魚的畸形率、出殼率、心率等。

1.4 觀察指標 分析不同TDMPP 濃度對斑馬魚幼魚致死、生長及出殼的影響,TDMPP 早期暴露對斑馬魚幼魚的致畸作用,不同濃度TDMPP 對斑馬魚肝臟及胰腺的發育毒性影響。

1.5 統計學方法 采用 GraphPad 6.0 對實驗數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),多重比較應用 Tukey 分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同TDMPP 濃度對斑馬魚幼魚致死、生長及出殼的影響分析 TDMPP 對斑馬魚致死、出殼、身長的影響在一定濃度范圍內,TDMPP 濃度與幼魚死亡率呈正相關(r=0.8707,P＜0.05)。見圖 1A～1B。濃度達到2000 μM 時導致全部幼魚死亡,死亡率為 100%。TMDPP對斑馬魚胚胎的24h LC50 為1792 μM,72 h LC50 為1195 μM。在處理到72 h pf 時,與對照組相比,TDMPP 高濃度組(100 μM)能夠顯著抑制斑馬魚幼魚生長(P＜0.01),而TDMPP 低濃度組與對照組比較差異無統計學意義(P=0.9832＞0.05),見圖1C。檢查72 h出殼率時,出殼率與暴露濃度呈現正相關(r=0.9078,P＞0.05)。見圖1D。

圖1 不同TDMPP 濃度對斑馬魚幼魚致死、生長及出殼的影響

2.2 TDMPP 早期暴露對斑馬魚幼魚的致畸作用分析 72 h pf 時形態學觀察發現,TDMPP 對斑馬魚的致畸作用主要體現在心包水腫、脊柱畸形、腹腔水腫和色素形成異常等。見圖2A～F。定量分析顯示,低濃度組和對照組的表型率比較差異無統計學意義(P=0.2726＞0.05),但高濃度組與對照組的表型率比較差異具有統計學意義(P=0.0022＜0.05)。對于其他三種表型,可以發現相似的情況,100 μM TDMPP 早期暴露導致脊柱彎曲、腹腔水腫和色素減弱的表型率均顯著高于對照組,差異具有統計學意義(P=0.0244、0.0072、0.0118＜0.05)。圖2G～J。

2.3 不同濃度TDMPP 對斑馬魚肝臟及胰腺的發育毒性影響分析 TDMPP(10 μM 和 100 μM)處理3 d 后,應用轉基因斑馬魚在體式熒光顯微鏡下觀察肝臟形態。對照組可以看到清晰的紅色熒光標記的肝臟,形態正常。見圖3A。然而 TDMPP 處理組能夠觀察到明顯的肝臟異常形態,發育受到阻滯,且呈現顯著的劑量-效應關系。Image pro 定量分析進一步確認,處理組斑馬魚個體的肝臟尺寸小于對照組,100 μM 高濃度組與對照組和低濃度組比較,差異具有統計學意義(P=0.0019、0.0274＜0.05)。見圖3B。TDMPP 早期暴露對胰腺發育同樣有顯著的抑制作用。見圖 3A。低濃度組和高濃度組中幼魚胰腺尺寸均顯著低于對照組,差異具有統計學意義(P=0.0016、0.0009＜0.05)。見圖3C。

圖2 TDMPP 早期暴露對斑馬魚幼魚的致畸作用

圖3 不同濃度TDMPP 對斑馬魚肝臟及胰腺的發育毒性影響

3 討論

本研究針對新型有機磷阻燃劑 TDMPP 進行了系統全面的毒理學評價,包括致死率、致畸率、出殼率和心率等。同時應用多種高效的轉基因斑馬魚品系,評估TDMPP 早期暴露對肝臟、胰腺及心臟的發育毒性。

本研究發現,TDMPP 早期暴露可誘導幼魚出現明顯心包水腫、脊柱彎曲、腹腔水腫和色素形成異常等表型,且高濃度組變化明顯。出殼是胚胎器官發育的重要指標,但是本研究中作者沒有觀察到 TDMPP 對出殼有影響,而出殼后測量身長發現,TDMPP 高濃度組對生長具有顯著的抑制作用。有研究表明,斑馬魚早期生長遲緩可能與芳香烴受體(AHR)介導的毒副作用相關,這種毒作用是血流減少導致的生長所需的營養物質缺失所引發［9］。

斑馬魚具有和哺乳動物相似的肝臟代謝功能,對外源化合物呈現相近的代謝途徑,在72 h pf 發育成全功能性肝臟［10］。本研究首次發現,TDMPP 早期暴露(2～72 h)可顯著抑制斑馬魚的肝臟發育,處理組呈現明顯的濃度-效應關系,處理組個體的肝臟形態明顯處于異常狀態。有體外研究表明,TDMPP 具有較強的類雌激素作用,其效力甚至高于知名的外源雌激素雙酚A(BPA),可激活 ERα 表達［7］。因此 TDMPP 抑制肝臟發育可能通過雌激素核受體介導,相關內容值得進一步深入研究。在小鼠的研究中表明,TDMPP 具有內分泌干擾物特性,能夠直接進入新生小鼠大腦,從而影響與性別相關的腦結構變化,并損傷雌性的生殖功能［6］。

斑馬魚的胰腺發育早期起源于胚胎背側的內胚層細胞,而位于腹側的內胚層分化成肝芽,發育成胰腺組織的內胚層細胞分別于24 h pf 在腸道的背部面上形成初級胰島,隨后在胰島前端,34 h pf 后形成胰管、胰外分泌腺和部分胰內細胞。本研究中發現,胰腺是除肝臟外的另一個主要靶器官,TDMPP 處理72 h pf 能夠顯著抑制胰腺的發育。相似的研究報道,阻燃劑PFOS 早期暴露會顯著斑馬魚胚胎的胰腺長度和面積,干擾脂質代謝相關基因的表達。

綜上所述,斑馬魚幼魚在早期暴露于 TDMPP 后導致發育遲緩、誘導畸形,其主要的毒作用靶器官為肝臟和胰腺,可為TDMPP 的生產、應用和安全性評價提供直接依據。