結核γ—干擾素酶聯免疫法釋放試驗結果及影響相關因素分析

徐 寧，鄭 瑞，毛小琴，撒亞蓮

(1.云南省第一人民醫院 檢驗科;2.云南省臨床檢驗中心;3.云南省臨床微生物重點實驗室;4.云南省第一人民醫院 臨床基礎醫學研究所，云南 昆明650032)

快速診斷和治療是結核病控制的關鍵問題，至今沒有一種準確、快速、可靠，檢測結核分枝桿菌(結核菌)感染的方法[1]。常用細菌學檢測方法，如痰涂片鏡檢法和培養法，以及結核菌臨床基因擴增法、血清學檢測方法等。但這些方法存在敏感性較低、特異性較差、操作復雜，檢測周期長等問題[2]。世界衛生組織 2014 年的報告顯示，結核病診斷率僅為37%[3]，即使在發達國家，僅有50%結核病例通過細菌學方法證實[4]。因此，開發快速特異診斷結核病的方法已經成為控制結核病蔓延的緊迫任務。結核菌可誘導強烈的細胞免疫反應，因此，檢測結核菌特異的T淋巴細胞可作為檢測感染的一種新路徑[5]。本研究對960例γ干擾素試驗結果進行調查分析，探討其在結核病快速診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用整群定點抽樣法，選取2019年1月至 2019年12月在云南省第一人民醫院住院的疑似結核患者為研究對象，其中男528例，女432例，年齡40-67歲，平均(49.14±17.42)歲。

1.1.1納入標準 陽性組均為云南省第一人民醫院門診及住院患者，且經相關病理及細菌學檢查和臨床轉歸而最終證實的結核感染患者516例，其中男 288例，女 228 例，年齡 49-67歲，平均(49.14±17.81)歲。而陰性組則是疑似結核，最終通過其他檢查排除結核患者444例。其中男240例，女204例，年齡40-58歲，平均(40.86±17.04)。ATB(active tuberculosis,ATB)的診斷標準為：除具有典型的臨床癥狀和影像學表現外，痰、支氣管肺泡灌洗液、組織或其他送檢標本中MTB培養陽性。LTBI(latent tuberculosis infection,LTBI)的診斷標準為：常規篩查中結核γ—干擾素試驗陽性，但無結核病相關的臨床癥狀和影像學表現[6]

1.1.2排除標準(任意一條滿足) (1)年齡<18歲；(2)免疫功能低下人群(糖尿病、惡性腫瘤、慢性腎功能衰竭患者)；(4)抗結核治療>2周者。

1.2 研究方法

1.2.1樣本收集與要求 住院符合條件患者入院后次日早晨空腹采樣新鮮的肝素鈉抗凝全血4 ml，室溫保存，及時送檢。同時患者檢測痰涂片，有條件者纖支鏡刷片查抗酸桿菌，肺外結核取相關部位涂片查抗酸桿菌，IGRA(結核γ—干擾素酶聯免疫法釋放試驗)及病理送檢。

1.2.2試劑與器材 采用QIAGEN 的結核分枝桿菌特異性細胞反應檢測試劑盒(酶聯免疫法)

1.3 統計學分析

應用統計軟件 SPSS24.0 分析處理數據，單因素分析采用t檢驗和方差分析，多因素分析采用logistic回歸分析,且當P<0.05時認為差異具有統計學意義。檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 γ-干擾素與病理結果的關系

干擾素釋放試驗結果和最終病理確診結果的比較使用配對卡方檢驗，P值<0.001為差異有統計學意義，干擾素試驗結果和最終病理確診結果之間有相關。優劣性檢驗的雙側P值為0.290，差異無統計學意義，尚不能認為兩種方法的測定結果有差別，證明γ干擾素釋放試驗結果和病理結果有較高一致性，見表1。

表1 960例患者干擾素釋放試驗結果與最終確診結果的比較

2.2 干擾素釋放量與單核細胞數量、C反應蛋白、淋巴細胞數量的相關性分析

P值分別為0.991、0.542、0.000，單核細胞數量和C反應蛋白的P值>0.05，沒有相關性。淋巴細胞數量的P值<0.05，有相關性，相關系數為0.784。

2.2.1干擾素釋放量與單核細胞數量相關分析,見圖1。

圖1 干擾素釋放量與單核細胞數量沒有相關性

2.2.2干擾素釋放量與C反應蛋白數量相關分析，見圖2。

圖2 干擾素釋放量與C反應蛋白數量無相關性

2.2.3干擾素釋放量與淋巴細胞數量相關分析，見圖3。

圖3 γ干擾素釋放量和淋巴細胞數量呈正相關

2.3 干擾素釋放試驗結果影響因素分析

本研究960例干擾素釋放試驗結果陽性516例，干擾素釋放試驗結果陰性444例，實驗結果顯示：在年齡、干擾素釋放量、淋巴細胞、CRP等方面差異有統計學意義(P< 0.05)；而在性別、血沉方面差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。為了剔除混雜因素，將單因素有統計學意義的因素進行多因素分析，以陽性、陰性作為應變量，以年齡、干擾素釋放量、淋巴細胞、CRP、激素使用作為自變量納入logistic回歸分析；結果提示：5個因素都是干擾素實驗結果的影響因素。

表2 干擾素釋放試驗結果影響因素分析

3 討論

γ-干擾素釋放試驗(Gamma-interferon release test，IGRAs)是檢測結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)特異性抗原刺激T細胞產生的γ干擾素，以判斷是否存在MTB的感染。IGRAs可彌補PPD試驗的不足，目前多個國家已將其用于診斷MTB潛伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)，LTBI是宿主感染MTB后的一種特殊狀態，感染者體內的MTB處于持留狀態，不能診斷為活動性結核病，但具有發展為活動性結核病的風險。對LTBI的高危人群進行早期診斷和適當干預，在結核病控制中具有積極意義[7]。研究結果提示，IGRAs診斷MTB感染的特異度與病理最終結果符合性很高，與相關研究相同[8]，而對云南HIV高發地區，其中有13例HIV患者，結核是HIV感染者死亡的首要原因[9]，而IGRAs尤其是細胞檢測)受CD4+T細胞數量的影響較小，因為IGRAs檢測過程中已對單個核細胞數量進行了標準化，即在檢測程序上消除了淋巴細胞數量減少對檢測結果的影響，從而提高了其敏感性。IGRAs診斷采用MTB的RDl區基因編碼抗原多肽作為特異性抗原，主要有相對分子質量為6000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相對分子質量為10000的培養濾液蛋白(CFP-10)抗原并在此基礎上增加了TB7.7抗原多肽[10]。而ESAT-6和CFP-10主要存在于MTB復合群[11]，而在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中缺失，因此IGRAs的特異度較好,但在敏感性上γ干擾素存在一定的局限性[12]，特別是類風濕關節炎等自身免疫性疾病、器官移植等免疫功能受損患者及糖尿病等特殊患者[13-15]，因其自身原因，或接受糖皮質激素或腫瘤壞死因子TNF-a拮抗劑等免疫抑制藥物治療導致免疫功能缺陷，病人免疫系統受損，致使T細胞無法產生γ-干擾素，而導致IGRAs的敏感度并未高于PPD試驗[16]，但是這類患者是LTBI發展為結核病的高風險人群，在臨床工作中給予IGRAs檢測結果的解釋一定要根據患者綜合因素進行分析。

本研究重點關注了年齡、γ干擾素釋放量、淋巴細胞數量、C反應蛋白、單核細胞等各種影響因素，根據相關文獻報道，非甾體抗炎類藥物[17]、T細胞活化抑制劑[18]、應用糖皮質激素導致白細胞總數增多，淋巴細胞減少，導致γ干擾素減少[19]。本研究也證實，年齡、γ-干擾素釋放量、使用激素、淋巴細胞數量、CRP五個因素P值均小于0.05，從而證實這些因子是γ干擾素試驗的結果不確定時需要復查的確定因素。在現有結核診斷方法存在諸多缺陷的今天，γ干擾素結合相關影響因素判斷結核感染，可以給臨床醫師提供有力參考，指導臨床實踐。