下調miR-128-3p 緩解膿毒癥大鼠急性肺損傷的炎癥反應和肺組織形態學的影響

黃 鐘孫 潔姚振濱李桂花?許曉剛

(1.石河子大學醫學院第一附屬醫院急診內科,新疆石河子 832000;2.石河子大學醫學院第一附屬醫院院內感染控制辦公室,新疆石河子 832000)

膿毒癥是機體對感染反應失調所致的危及生命的器官功能障礙,其發病率和死亡率均較高[1]。雖然近年來,醫藥發展迅速,但對于嚴重的膿毒癥患者機體對感染刺激的機體的免疫、內分泌代謝、炎癥、凝血等系統在感染時的綜合反應的治療仍不完善[2]。 臨床上所采取的治療方法以支持治療為主,但隨著對分子細胞學研究的深入,miRNA 在調控細胞凋亡及相關惡性生物學特征中發揮了重要作用[3]。 近年來隨著研究的深入發現miR-128-3p在相關疾病中扮演重要角色。 趙陽等[4]研究表明miR-128-3p 過表達可以靶向MAPK1 抑制膀胱癌細胞株的侵襲,遷移和上皮間質轉化。 侯紹蔚研究表明miR-128-3p 靶向TCF4 抑制黑色素瘤A375 細胞增殖、侵襲[5]。 張華東等[6]研究表明 miR-128-3p 能通過靶向BMI 調控炎癥反應。 由此我們推測miR-128-3p 對毒癥大鼠急性肺損傷中相關細胞的凋亡及炎癥反應可能有一定的影響。 但目前關于miR-128-3p 在膿毒癥大鼠急性肺損傷的炎癥反應和肺組織形態學的影響研究較少。 本文旨在研究miR-128-3p 對膿毒癥大鼠急性肺損傷炎癥反應、肺組織形態學的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級 3 周齡 SD 大鼠,體重(60±6)g,60 只,購自廣東醫學院實驗動物中心[SCXK(粵)2019-0050],于廣東省檢迅檢測科技有限公司SPF 級動物房中進行飼養[SYXK(粵)2019-0216],自由飲水和進食,溫度維持25℃左右,光照/黑暗各12 h,常規飼養。 本實驗通過本院動物倫理委員會批準(20180201);動物實驗嚴格遵循動物實驗減少(reduction)、優化(refinement)和替代(replacement)-3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

TRAIL(英國 Pepro Tech 公司); Caspase-3、Caspase-9、轉化生長因子-β(Transformed growth factor-β, TGF-β) 抗體(貨號:ab179695;批號:20190103)和 α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(貨號:ab240678;批號:20190401)(艾博抗公司);HRP 羊抗兔 IgG、HRP 羊抗鼠IgG 抗體(美國Thermo 公司);白細胞介素-6(interleukin- 6, IL-6)試劑盒(貨號:SBJ-H0465;批號20190301)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(貨號:SBJ-H0038;批號20190304)、一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)ELISA 試劑盒購(貨號:SBJ-H1350;批號:20190307)(南京森貝伽生物科技有限公司);MASSON 染液(貨號:SNM346,北京百奧萊博科技有限公司);TUNEL 染液(貨號:11684817910,上海意杰生物科技)。

Sysmex-chemix-180 全自動生化分析儀(日本Furuno Electric 公司);TDL-5 臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);3w-5 低溫離心機(湖南恒諾離心機有限公司);SG-51 金相顯微鏡(上海光學儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及建立模型

將60 只大鼠適應性喂養1 周,采用隨機分組法將大鼠分為:假手術組、膿毒癥模型組、空白轉染組和miR-128-3p 沉默組,每組15 只,除假手術組其余各組大鼠采用盲腸結扎穿孔法制備大鼠膿毒癥模型,操作流程參考文獻[7]:大鼠麻醉,去毛發,腹正中線作長3 cm 的切口,結扎位置選取距離盲端1.5 cm 處,結扎遠端進行針穿并擠出少許腸管內糞便,再將盲腸回納腹腔,關腹并進行補液。 假手術組不結扎及針頭對穿盲腸,其余步驟相同。 判斷模型成功標準參考秦怡等[8]研究,大鼠活動減少、攝食減少、嗜睡、蜷縮、眼角出現分泌物等,7 h 血培養陽性為模型成功,同時導致肺功能損傷為造模成功。 肺纖維化評價標準[9]:呈現出慢性肺泡炎且其中成分出現進行性損害,纖維組織大量增生、間質膠原紊亂甚至出現囊性變化,肺泡陰影呈現出磨玻璃狀,嚴重進展時可出現結節狀或網狀陰影。

1.3.2 干預

空白轉染組構建空白質粒并轉染大鼠;miR-128-3p 沉默組構建慢病毒質粒并通過尾靜脈注射轉染大鼠,設計3 個miR-128-3p 基因的干擾片段,合成單鏈DNA 片段,片段兩端分別含酶切位點,退火形成雙鏈DNA。 雙酶切miR-128-3p 沉默基因載體和DNA 片段,3"4 DNA 連接酶連接(由武漢華聯科有限公司完成)。

1.3.3 RT-PCR 檢測 miR-128-3p 表達

肺功能檢測完畢24 h 后,處死大鼠并取出肺組織,TRIzol 提取總RNA、反轉錄cDNA 鏈并作為PCR擴增模板,95℃ 2 min、95℃ 8 s、58℃ 35 s、72℃ 40 s、40 個循環,使用2-ΔΔCt計算出待測基因相對表達量。miR-128-3p:上游引物:5’-GTGCAGGGTCCGA GGT-3’下游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

GADPH:上游引物:5’-CTCAGACACCATGGG GAGGTGA-3’ 下游引物:5’-ATGATCTTGAGGCTG TTGTCATA-3’。

1.3.4 各組大鼠肺功能的檢測

完成大鼠基因干預24 h 后,采用 AniRes2005動物肺功能分析系統,在常溫下,將大鼠置體描器內,檢測大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換情況。

1.3.5 大鼠外周血相關因子檢測

斷頸法處死大鼠后立即取大鼠血液2 mL,在離心機中以 1500 r/min 離心 15 min,取上清液用ELISA 法檢測 IL-6、TNF-α、iNOS 含量水平,按照試劑盒說明書操作。

1.3.6 HE 染色觀察肺組織及病理損傷情況

HE 染色觀察大鼠肺上皮組織及病理損傷情況,取大鼠肺上皮組織,依次進行常規石蠟包埋、切片、蘇木精染色、伊紅染色、封片、高倍鏡觀察大鼠肺組織情況。

1.3.7 TUNEL 染色檢測大鼠肺組織細胞凋亡情況

將肺上皮組織切片,依次經過二甲苯清洗、乙醇清洗、蛋白酶K 室溫反應15 min、10%中性甲醛固定、乙醇乙酸浸潤、3%過氧化氫浸潤、TdT 酶緩沖溶液孵育5 min、終止液終止反應20 min、過氧化酶標記物抗體孵育20 min、DAB 顯色30 min、無水乙醇和二甲苯固定、晾干、封片,于熒光顯微鏡下觀察,凋亡率=陽性細胞/總細胞×100%。

1.3.8 Western blot 檢測蛋白表達水平

提取肺組織總蛋白,依次經過SDS 電泳、蛋白轉PVDF 膜、室溫封閉2 h、加入待檢測蛋白一抗,4℃孵育過夜,加入二抗37℃孵育2 h,顯色液顯色,進行目標蛋白條帶灰度值吸光度分析。

1.3.9 MASSON 染色檢測大鼠肺組織情況

大鼠肺組織石蠟切片,進行Masson 染色試劑盒中A、B 染色液染色前和染色后步驟與 HE 染色相同。

1.4 統計學方法

使用Sigma Stat 3.5 軟件進行數據統計,使用GraphPad Prism 5 軟件作圖,計量資料采用平均數±標準差(ˉx±s)表示,多組間用單因素方差分析,兩兩比較用LSD 法,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測 miR-128-3p 表達

由RT-PCR 檢測miR-128-3p 表達發現,相比假手術組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉染組大鼠miR-128-3p 表達顯著升高,差異有統計學意義(t=12.321;P=0.000);相比空白轉染組,miR-128-3p沉默組大鼠miR-128-3p 表達顯著降低,差異有統計學意義(t=13.368;P=0.000),見圖1。

2.2 各組大鼠肺功能的檢測結果

檢測大鼠肺功能可以看出,相比假手術組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉染組大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);相比空白轉染組,miR-128-3p沉默組大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.3 大鼠外周血相關因子檢測

使用ELISA 檢測大鼠外周血炎癥因子檢測結果顯示,相比假手術組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉染組大鼠外周血IL-6 含量水平、iNOS 含量水平和TNF-α 含量水平均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠 IL-6 含量水平、iNOS 含量水平和 TNF-α 含量水平均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

注:I:假手術組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術組相比,?P<0.05;與空白轉染組相比,#P<0.05。圖1 RT-PCR 檢測 miR-128-3p 表達Note.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III,Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.Figure 1 Expression of miR-128-3p detected by RT-PCR

2.4 HE 染色觀察肺組織及病理損傷情況

HE 染色觀察各組大鼠肺組織病理損傷發現,假手術組細胞分布均勻,且基本無壞死細胞;膿毒癥模型組和空白轉染組大鼠肺組織細胞排列散亂,且數量缺失明顯增多,壞死細胞較多;miR-128-3p沉默組細胞排列較均勻,壞死細胞明顯較少,見圖2。

2.5 TUNEL 染色檢測大鼠肺組織細胞凋亡情況

TUNEL 染色觀察各組大鼠肺組織細胞凋亡情況發現,相比假手術組凋亡率為(2.00±2.00)%,膿毒癥模型組大鼠和空白轉染組大鼠肺組織細胞凋亡率分別為(38.50±5.00)%和(41.05±7.00)%顯著升高,差異有統計學意義(t=8.984;P=0.000);相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠肺組織細胞凋亡率為(9.00±3.00)%顯著降低,差異有統計學意義(t=5.321;P=0.000),見圖3。

2.6 各組大鼠肺組織中Caspase-3 和Caspase-9 的表達檢測結果

蛋白質印記實驗檢測大鼠肺組織凋亡蛋白表達結果發現,相比假手術組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉染組大鼠肺組織cleaved cas3/Caspase-3 和cleaved cas9/Caspase-9 比值顯著升高,差異有統計學意義(t=15.054,P=0.000;t=9.698,P=0.000);相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠cleaved cas3/Caspase-3 和 cleaved cas9/Caspase-9 比值顯著降低,差異有統計學意義(t=33.696,P=0.000;t=7.369,P=0.000),見圖4。

2.7 MASSON 染色檢測大鼠肺組織情況

MASSON 染色觀察各組大鼠肺組織傷發現,假手術組的大鼠肺組織細胞分布均與且有序,膿毒癥模型組肺組織纖維化和損傷程度嚴重,miR-128-3p 沉默組肺組織纖維化和損傷程度減輕,見圖5。

2.8 各組大鼠肺組織 TGF-β 和 α-SMA 表達情況

蛋白質印記實驗檢測大鼠肺組織炎癥相關蛋白表達結果發現,相比假手術組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉染組大鼠 TGF-β 蛋白相對表達和 α-SMA 蛋白相對表達顯著升高,差異有統計學意義(t=15.874,P=0.000;t=10.087,P=0.000);相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠TGF-β 蛋白相對表達和α-SMA 蛋白相對表達顯著降低,差異有統計學意義(t=10.344,P=0.000;t=5.360,P=0.000),見圖6。

表1 各組大鼠肺功能的檢測結果( ±s,n=15)Table 1 Test results of lung function of rates in each group

表1 各組大鼠肺功能的檢測結果( ±s,n=15)Table 1 Test results of lung function of rates in each group

注:與假手術組相比,?P<0.05;與空白轉染組相比,#P<0.05。Note.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.

組別Groups靜息通氣量(mL/kg)Resting ventilation氣道阻力改變Airway resistance changes肺容積變換(mL)Lung volume changes假手術組 Sham-operated group 3.42±0.19 74.34±6.36 0.27±0.03膿毒癥模型組 Sepsis model group 1.59±0.22? 53.42±9.23? 0.11±0.04?空白轉染組 Blank transfection group 1.62±0.24? 52.46±5.16? 0.12±0.01?miR-128-3p 沉默組 miR-128-3p silencing group 2.81±0.32# 68.02±7.18# 0.24±0.02#F 201.767 34.370 134.000 P<0.001 <0.001 <0.001

表2 大鼠外周血炎癥因子檢測( ±s,n=15)Table 2 Detection of inflammatory factors in peripheral blood of rats

表2 大鼠外周血炎癥因子檢測( ±s,n=15)Table 2 Detection of inflammatory factors in peripheral blood of rats

注:與假手術組相比,?P<0.05;與空白轉染組相比,#P<0.05。Note.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.

組別 Groups IL-6(pg/mL) iNOS(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手術組 Sham-operated group 18.07±3.35 42.08±6.09 27.03±2.35膿毒癥模型組 Sepsis model group 94.85±11.23? 205.92±24.11? 136.35±17.43?空白轉染組 Blank transfection group 98.83±16.44? 201.08±21.24? 138.53±13.26?miR-128-3p 沉默組 miR-128-3p silencing group 37.12±4.67# 81.77±7.52# 59.19±8.28#F 232.139 370.188 340.164 P<0.001 <0.001 <0.001

注:I:假手術組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。圖2 HE 染色觀察肺組織病理損傷情況(n=15)Note.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Figure 2 Observation of lung tissue and pathological damage by HE staining

注:A:TUNEL 染色圖;B:肺組織細胞凋亡率。 I:假手術組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術組相比,?P<0.05;與空白轉染組相比,#P<0.05。圖3 TUNEL 染色檢測大鼠肺組織細胞凋亡情況(n=15)Note.A, TUNEL staining images.B, Apoptosis rates of lung tissues.I, Sham-operated group.II,Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.Figure 3 Apoptosis of lung tissues detected by TUNEL staining

注:A:蛋白質印記圖;B:相關蛋白相對表達量。 I:假手術組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術組相比,?P<0.05;與空白轉染組相比,#P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織中Caspase-3 和Caspase-9 的表達情況(n=15)Note.A, Western blot images.B, Relative expression levels of related proteins.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P < 0.05.Compared with blank transfection group,#P<0.05.Figure 4 Expression of Caspase-3 and Caspase-9 in lung tissues of rats in each group

注:I:假手術組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。圖5 MASSON 染色檢測大鼠肺組織情況結果(n=15)Note.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Figure 5 Lung tissue conditions of rats detected by MASSON staining

注:A:蛋白質印記圖;B:相關蛋白相對表達量。 I:假手術組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術組相比,?P<0.05;與空白轉染組相比,#P<0.05。圖6 各組大鼠肺組織TGF-β 和α-SMA 表達情況(n=15)Note.A, Western blot images.B, Relative expression levels of related proteins.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.Figure 6 Expression of TGF-β and α-SMA in lung tissues of rats in each group

3 討論

膿毒癥可以序貫出現多個器官功能損傷,其中肺部損傷較為常見[10]。 其中靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換是常見的幾個肺功能指標。 靜息通氣量是指每分鐘靜息通氣量是指在平靜狀態下每分鐘進或出肺的氣體總量[11];氣道阻力是指氣道內單位流量所產生的壓力差[12];當靜息通氣量和氣道阻力改變降低后可能因為肺部出現水腫或炎癥反應引起肺阻塞。 本研究發現,相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換顯著升高。 說明抑制miR-128-3p的表達后,大鼠肺功能的到了有效緩解,這可能是因為炎癥得到了有效抑制,使得大鼠肺部的水腫也得到了緩解。 黃小洵等[13]研究表明:改善靜息通氣量及相關肺功能指標可以有效緩解膿毒癥導致的肺損傷,與本研究得出的結論相一致。

細胞因子主要可分為促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子兩種[14]。 目前研究較多的促炎性細胞因子包括:TNF-α、IL-1β,IL-6 和 IL-8 等;抗炎性細胞因子則包括:IL-4,IL-10,TNF 受體(TNF-sr)等[15],本研究中主要研究 IL-6、iNOS 和 TNF-α 這幾種相關因子。 為探究大鼠肺功能得到了的改善是否與降低炎癥反應相關,本研究檢測了大鼠外周血的相關因子發現,相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠IL-6 含量水平、iNOS 含量水平和TNF-α含量水平均顯著降低。 說明大鼠的肺功能得到有效的改善確實與炎癥反應相關。 同時為了進一步驗證,通過MASSON 染色觀察各組大鼠肺組織發現,miR-128-3p 沉默組大鼠肺組織損傷及炎性浸潤也有顯著的改善。 吳松林等[16]研究表明:長鏈非編碼RNA 的表達可以有效抑制膿毒癥導致的肺損傷患者外周血內的炎癥因子水平,與本研究得出的結論相類似。

除了抑制炎癥反應以外,防止細胞的凋亡也是重要方法之一。 本研究通過TUNEL 染色,相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠肺組織細胞凋亡數目顯著降低,為了探究其原因,使用蛋白質印跡檢測了相關凋亡基因的表達發現,相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠 cleaved cas3/Caspase-3 和cleaved cas9/Caspase-9 比值顯著降低。 這可能是因為Caspase 家族蛋白為調控凋亡的主要蛋白之一。抑制了miR-128-3p 的表達,使得肺組織細胞凋亡啟動子 Caspase-3 的表達受到了抑制,減緩了下游caspase-9 的活化,使得凋亡信號減弱,反過來抑制了Caspase-3 的激活,防止了肺組織細胞的凋亡。 姜永帥等[17]研究表明:抑制膿毒癥患者體內的Caspase 家族凋亡蛋白的表達可以有效緩解膿毒癥導致的相關器官功能損傷,與本研究得出的結論相一致。

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變[18]。 大鼠肺部出現損傷后會伴隨肺部纖維化。 肺纖維化主要標志包括:α-SMA 和 TGF-β 等;α-SMA 主要存在于肌成纖維細胞漿,是肌成纖維細胞的主要標志分子[19];TGF-β是肺纖維化最關鍵的細胞因子,它與肺纖維化發生發展、細胞外基質代謝關系密切[20]。 本實驗通過MASSON 染色觀察發現,膿毒癥模型組大鼠肺組織出現明顯的組織纖維化,與膿毒癥模型組相比,肺組織的纖維化和損傷明顯得到改善為探究其原因,檢測了與肺纖維化相關的蛋白,發現相比空白轉染組,miR-128-3p 沉默組大鼠TGF-β 蛋白相對表達和α-SMA 蛋白相對表達顯著降低。 說明抑制 miR-128-3p 基因的表達可以有效防止肺纖維化,其作用機制可能與抑制肺纖維化相關蛋白的表達相關。秦靜等[21]研究表明:抑制大鼠體內 TGF-β 蛋白相對表達和α-SMA 蛋白相對表達可以有效治療肺纖維化進展,與本研究得出的結論相一致。

綜上所述,下調miR-128-3p 可以緩解膿毒癥大鼠急性肺損傷,其作用機制可能與降低大鼠體內炎癥反應并抑制肺組織細胞的凋亡相關。