胍基丁胺通過調節Nrf2/HO-1 信號通路減輕丙泊酚誘導的新生大鼠的神經毒性

張少華張彥芳曹 萌李 燕廖立夏王貝貝

(1.南陽市第一人民醫院兒一科,河南南陽 473000; 2.新鄉醫學院第一附屬醫院內分泌二病區,河南新鄉 453100)

丙泊酚因其起效快,連續輸注而無累積和恢復快等特點,已在兒科和產科患者中普遍用作靜脈麻醉藥和鎮靜藥[1]。 胎兒和新生兒應用丙泊酚可引起短期和長期神經毒性,導致神經變性[2]。丙泊酚會引起劑量依賴的變化,導致新生神經元和胚胎神經干細胞的損傷,并對嚙齒動物造成永久性的神經損傷[3-4]。 丙泊酚對嬰兒大腦發育的潛在副作用也引起了人們對其安全性的關注,因此開發新的藥物來預防丙泊酚的神經元副作用具有重要意義。

胍基丁胺(agmatine)是L-精氨酸在精氨酸脫羧酶作用下的產物,分布于哺乳動物體內所有器官和組織,在中樞神經系統可作為抗抑郁藥物,促進記憶的鞏固[5],具有抑制肝癌細胞、血管平滑肌細胞、星形膠質細胞等細胞增殖的作用[6]。 相關研究表明,胍基丁胺可在OGD 模型中明顯減少神經元死亡,保護缺血神經元,并減少NCAO 模型腦梗死面積[7]。 目前未見關于胍基丁胺對丙泊酚誘導的新生大鼠的神經毒性具體作用機制的相關報道。 本文旨在探討胍基丁胺對丙泊酚誘導的新生大鼠的神經毒性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只無特定病原級 (specefic pathogen free,SPF) 健康雄性SD 大鼠,來源于成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2019-031],3 周齡,體重(50±3)g,飼養于河南省精神病醫院[SYXK(豫)2020-0010]。 常規飼養7 d。 本文研究均經過我院倫理委員會批準(IACUC-20191012-11),符合3R 原則。

1.2 主要試劑

胍基丁胺(S98238)購自上海源葉生物科技有限公司,化學式:C5H14N4,分子量:130.19,純度≥97%;丙泊酚(100806-201803)購自中國食品藥品檢定研究院,化學式:C12H18O,分子量:178.27,純度≥99.9%;TTC 染液(D025-1-3)、蘇木素-伊紅染液(D006-1-1)購自南京建成生物工程研究所;Nissl 染色液(C0117)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物技術研究所;兔抗 BDNF ( ab226843 )、 NGF ( ab6199 )、 Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、Nrf2(ab31163)、p-Nrf2(ab137550)、HO-1(ab13243)單克隆抗體購自英國Abcam 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組

將大鼠隨機分為 5 組:Control 組、Propofol 組、Propofol + Agmatine 1.25 mg/kg 組、 Propofol +Agmatine 2.5 mg/kg 組和 Propofol+Agmatine 5 mg/kg 組。 參照 Xiao 等[8]方法對除 Control 組外各組腹腔注射丙泊酚50 mg/kg 誘導神經毒性損傷,Control組腹腔注射等量生理鹽水。 當前期進行預實驗給藥時,給藥劑量低于或等于5 mg/kg 時,均未出現明顯毒性作用,因此選擇給藥劑量5 mg/kg 為最高給藥劑量,倍數遞減劑量確定給藥梯度為:5、2.5、1.25 mg/kg。 Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg 組、Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg 組和 Propofol+Agmatine 5 mg/kg 組腹腔注射胍基丁胺 1.25、2.5、5 mg/kg[9],Control 組和Propofol 組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 跳臺實驗

將各組大鼠于實驗前1 d 置于反應箱中適應3 min,實驗時將大鼠放在平臺上并接通銅柵電源,記錄各組大鼠3 min 內錯誤次數;第2 天直接將大鼠放于接通銅柵電源的平臺上,記錄3 min 內錯誤次數。

1.3.3 2,3,5-三苯基氯化四氮唑法

處死所有大鼠,取腦,稱取重量并石蠟包埋切片。 按照染液說明書,將新鮮腦組織切片置于裝有TTC 染液的培養皿中,37℃避光孵育30 min,用組織沖洗應用液將組織表面多余染色液沖洗掉,正常腦組織呈玫瑰紅色,梗死組織呈灰白色。 再將切片置于10%甲醛中固定24 h,稱重,記為濕重;剝離梗死組織,與正常組織一起放入烘箱,烘至恒重,稱重,記為干重。 然后計算大鼠腦含水率、腦指數。 腦含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%,腦指數(%)=大腦重量/體重×100%。

1.3.4 腦損傷評分

通過Longa 法[10]對各組大鼠神經功能缺陷、姿勢反射進行評分。

1.3.5 HE 染色

取各組大鼠腦組織石蠟包埋切片,采用蘇木素-伊紅(HE)染液,將石蠟切片脫蠟,蒸餾水潤濕組織,核染液染色5 min,水洗5 s,漿染液染色30 s,水洗后,濾紙吸干,無水乙醇脫水2 次后封片,在熒光顯微鏡下觀測。

1.3.6 Nissl 染色

取各組大鼠腦組織用10%福爾馬林固定液固定,常規脫水,石蠟包埋,冠狀切片,片厚5 μm,二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,Nissl 染色液染色,中性樹脂封片,光鏡下觀察大腦海馬組織尼氏小體變化。

1.3.7 Western blot

取各組大鼠腦組織用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取,BCA 試劑盒測定蛋白質含量。 提取等量的蛋白質樣品在100℃條件下變性5 min。 然后使用SDS-PAGE 凝膠電泳法分離并轉移至PVDF 膜,在4℃條件下加入相應一抗并孵育過夜,清洗,然后在4℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗,孵育 2 h,最后加入發光液,曝光處理。Image J軟件統計灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。 符合正態分布的計量資料以平均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胍基丁胺降低丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型犯錯次數、腦含水率和腦指數

通過跳臺實驗檢測各組大鼠犯錯次數結果如圖1A 所示,與Control 組相比較,Propofol 組犯錯次數顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組犯錯次數顯著降低(P<0.05);通過2,3,5-三苯基氯化四氮唑法檢測各組大鼠腦含水率、腦指數結果如圖1B、1C 所示,與Control 組相比較,Propofol 組腦含水率、腦指數顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組腦含水率、腦指數顯著降低(P<0.05)。

注:A:犯錯次數;B:腦含水率;C:腦指數。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與 Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖1 胍基丁胺對丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型犯錯次數、腦含水率、腦指數的影響Note.A, number of mistakes.B, Cerebral water content.C, Cerebral index.1,Control group.2, Propofol group.3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group.4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group.5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 1 Effects of guanidine on the number of errors, brain water content and brain index of propofol induced nerve injury in rat model

2.2 胍基丁胺降低丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型神經功能缺陷評分、姿勢反射評分

通過Longa 法評價各組大鼠神經功能缺陷評分、姿勢反射評分結果如圖2A、2B 所示,與Control組相比較,Propofol 組神經功能缺陷評分、姿勢反射評分顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組神經功能缺陷評分、姿勢反射評分顯著降低(P<0.05)。

2.3 胍基丁胺改善丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型病理損傷程度,升高BDNF、NGF 蛋白表達水平

通過HE 染色檢測各組大鼠海馬區病理損傷程度結果如圖3A 所示,Control 組海馬區神經元細胞排列整齊,結構清晰。 Propofol 組神經細胞排列紊亂,細胞形態發生變化,間隙增大,細胞核染色變深,核固縮。 Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組較 Propofol 組病理損傷程度均有不同程度明顯改善。 通過Western blot 檢測各組大鼠BDNF、NGF 蛋白表達水平結果如圖3B 所示,與 Control 組相比較,Propofol 組 BDNF、NGF 蛋白水平顯著降低(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組 BDNF、NGF蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:神經功能缺陷評分;B:姿勢反射評分。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與 Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖2 胍基丁胺對丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型神經功能缺陷評分、姿勢反射評分的影響Note.A,Neurologic deficit scores.B, Postural reflex score.1,Control group; 2, Propofol group; 3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group; 4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group;5,Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 2 Effects of guanidine on scores of neural functional defects and postural reflex in propofofo induced nerve injury rats

注:A:HE 染色檢測海馬區病理損傷;B:BDNF、NGF 蛋白表達。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與 Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖3 胍基丁胺對丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型病理損傷程度和BDNF、NGF 蛋白表達水平的影響Note.A, HE staining was used to detect pathological damage in the hippocampus.B, protein expression of BDNF and NGF.1, Control group; 2,Propofol group; 3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group; 4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group; 5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05; Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 3 Effects of guanidine on the degree of pathological damage and the expression levels of BDNF and NGF proteins in propofofo-induced nerve injury rat models

2.4 胍基丁胺抑制丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型海馬區組織凋亡,降低Bax/Bcl-2 比值

通過Nissl 染色檢測各組大鼠海馬區組織凋亡情況結果如圖4A 所示,與 Control 組相比較,Propofol 組大鼠Nissl 小體數目明顯減少,而Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組相比較 Propofol 組 Nissl小體數目明顯增多,說明胍基丁胺可以作用海馬體,提高神經元的存活;通過Western blot 檢測各組大鼠Bax、Bcl-2 蛋白表達水平結果如圖4B 所示,與Control 組相比較,Propofol 組 Bax/Bcl-2 比值顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組 Bax/Bcl-2 比值顯著降低(P<0.05)。

2.5 胍基丁胺升高丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白表達水平

通過 Western blot 檢測各組大鼠 Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達水平結果如圖5 所示,與Control 組相比較,Propofol 組p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白水平顯著降低(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組 p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:Nissl 染色檢測海馬區組織細胞凋亡;Bax、Bcl-2 蛋白表達。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與Control 組比較,?P<0.05;與Propofol 組比較,#P<0.05。圖4 胍基丁胺對丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型海馬區組織凋亡和Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的影響Note.A, Nissl staining was used to detect the apoptosis of hippocampal tissue cells.Expression of Bax and Bcl-2 proteins.1, Control group.2, Propofol group.3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group.4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group.5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 4 Effects of guanidine on propofol induced hippocampal tissue apoptosis and Bax and Bcl-2 protein expression levels in rats with nerve injury

注:A: Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達;B:Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達直方圖。 與Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖5 胍基丁胺對丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達水平的影響Note.A, Nrf2, p-Nrf2, HO-1 protein expression.B, the protein expression histogram of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 5 Effects of guanidine on the expression levels of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1 proteins in propofol induced nerve injury rat models

3 討論

本研究顯示,胍基丁胺具有降低丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型犯錯次數、腦含水率和腦指數的作用。 犯錯次數的降低表明大鼠被動記憶能力升高。 腦指數的升高反映了腦水腫的嚴重程度,控制腦水腫可以改善神經損傷。 表明胍基丁胺能有效緩解丙泊酚誘導的神經損傷大鼠腦水腫。

神經功能缺陷評分是評價大鼠學習記憶能力的重要方法[11]。 由于腦損傷時可致姿勢反應性異常,出現異常姿勢、異常姿勢反射和異常運動,姿勢反射評分可早期發現腦損傷[12]。 本文研究結果說明,應用丙泊酚會對幼年大鼠學習記憶功能產生明顯影響。 而腹腔注射胍基丁胺后神經功能缺陷評分和姿勢反射評分降低,則表明胍基丁胺改善丙泊酚誘導的神經損傷大鼠的神經功能。

腦源性神經營養因子(BDNF)和神經生長因子(nerve growthfactor,NGF)是中樞神經級聯信號傳遞的關鍵分子,能促進神經突觸生長而建立神經元和靶細胞之間的突觸聯系[13]。 BDNF 參與中樞神經系統神經元的生長、發育、分化、再生以及修復,維持成熟神經元功能, 防止神經元壞死及凋亡[14]。BDNF 可作為判定幼兒腦損傷的的檢測指標。 NGF則是中樞神經系統重要的神經營養因子,在神經元保護和神經損傷后功能重建等方面起重要作用。王宏燕等[15]研究發現嚴重神經元損傷可造成神經元NGF、BDNF 表達下調,可通過升高NGF 和BDNF等神經營養因子表達修復大腦海馬區神經元。 本文研究發現,胍基丁胺具有升高丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型BDNF、NGF 蛋白表達水平的作用。提示胍基丁胺改善丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型神經元損傷。

注射丙泊酚可增加大鼠海馬細胞凋亡的頻率,由于丙泊酚對不同物種的未成熟神經元有不利影響,即使使用亞麻醉劑量的丙泊酚進行治療,也會在新生鼠的大腦皮層,尾狀和殼狀核中引起神經元凋亡[8]。 在本研究中,我們觀察到尼氏小體在胍基丁胺藥物組中增多,且Bax/Bcl-2 比值降低,Bax/Bcl-2 比值是決定細胞凋亡發生的關鍵指標[16]。 表明胍基丁胺可抑制丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型神經元細胞凋亡。

Nrf2 是一種體內的抗氧化轉錄因子,當機體受到不利刺激時在胞質中從Keap-1 上解離出來,啟動下游 HO-1、NQO1 及 SOD 等抗氧化基因的轉錄[17]。 HO-1 在體內具有抗氧化、細胞保護作用,其降解血紅素的產物代謝中可清除氧自由基、超氧陰離子,阻止蛋白、脂質過氧化。 在腦內激活Nrf2 途徑能起到神經保護的作用[18]。 本文研究發現,胍基丁胺具有升高丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白表達水平。 提示胍基丁胺通過調節Nrf2/HO-1 信號通路減輕丙泊酚誘導的新生大鼠的神經毒性。

綜上所述,胍基丁胺具有降低丙泊酚誘導的神經損傷大鼠模型犯錯次數、腦含水率、腦指數、神經功能缺陷評分、姿勢反射評分、Bax/Bcl-2 比值,改善病理損傷程度,升高BDNF、NGF 蛋白表達水平,抑制海馬區組織凋亡,這可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路實現的。