能力驗證計劃中酯酶-1 血清樣本穩定性研究

王 洪魏 杰光姣娜周佳琪肖 鏡岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

能力驗證的定義是利用實驗室間比對,按照預先制定的準則評價參加者的能力[1]。 檢測或校準實驗室通過參加能力驗證計劃,有助于實驗室發現問題,并找到問題的根本原因,完成糾錯,有助于實驗室實現修改和完善現有質量管理體系的目標,同時防止同類問題再次發生,為實驗室提供培訓機會,提升實驗室的質量管理水平和檢測水平。 能力驗證計劃對計劃中使用的樣本的穩定性有一定的要求:應證實能力驗證物品足夠穩定,確保這些材料在能力驗證實施過程(如儲存和運輸條件)中不會發生明顯變化[1]。 比對樣品的一致性對利用實驗室間比對進行能力驗證至關重要。 在實施能力驗證計劃時,組織方應確保能力驗證中出現的不滿意結果不歸咎于樣品之間或樣品本身的變異性。因此,對于能力驗證樣品的檢測特性量,必須進行均勻性檢驗和(或)穩定性檢驗[2]。 由此可見,樣本穩定性對于能力驗證計劃至關重要,直接決定能力驗證計劃的成敗。 因此,有必要根據樣本自身的特性,建立穩定性檢驗程序,執行穩定性檢驗方案,證實能力驗證樣本足夠穩定,確保能力驗證樣本在能力驗證實施過程中不會發生明顯變化,保證能力驗證計劃順利實施。

實驗動物在生物醫藥研究領域應用廣泛,實驗動物的質量直接影響生物醫藥研究中實驗數據的準確性和可重復性。 實驗動物的質量控制歸根究底是對動物實驗產出數據的質量控制。 本能力驗證計劃中的酯酶-1 血清樣本用于考察實驗室在實驗動物遺傳質量控制領域的檢測能力。 該能力驗證計劃中的檢測項目酯酶-1 的本質是蛋白質,容易受溫度影響發生變化,血清內成分復雜,溫度升高的情況下,在血清內生化因子作用下,酯酶-1 容易發生降解。 對于制備批量樣品的檢測能力驗證計劃,通常必須進行樣品均勻性檢驗。 對于穩定性檢驗,則可根據樣品的性質和計劃的要求來決定。 對于性質較不穩定的檢測樣品如生物制品,以及在校準能力驗證計劃中傳遞周期較長的測量物品,穩定性檢驗是必不可少的[2]。 因此,有必要制定穩定性檢驗程序,考察該樣本的保藏穩定性,加速穩定性,運輸穩定性和最終穩定性驗證。

本研究旨在考察酯酶-1 血清樣本的穩定性能否滿足能力驗證計劃的實施要求。 探討樣本穩定性檢驗對于能力驗證計劃的必要性和重要性。 研究結果能夠為能力驗證計劃中檢測項目的選擇提供基礎數據,同時為實驗動物領域能力驗證計劃的開展提供參考依據,從而進一步促進我國實驗動物質量檢測水平的提升。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8 周齡,雌性,SPF 級,CBA 雌性小鼠,體重19.3～20.9 g,8 周齡,20 只,SPF 級 C57BL/6 雌性小鼠,體重 19.1～21.6 g,8 周齡,20 只,購于于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。 所有實驗在中國食品藥品檢定研究院進行[SYXK(京)2017-0013]。 實驗經中國食品藥品檢定研究院審批(中檢動(福)第2019(A)001 號),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

試劑: 6-Dec - 2018Naphthyl acetate; 品 牌:SIGMA,貨號:N6875,批號:Lot#BCBF8417 V;Fast Blue RR Salt,品牌:SIGMA,貨號:F0500,批號:Lot#MKBK9189 V;Na2HPO4,品牌:國藥集團化學試劑有限公司,批號:20170109;KH2PO4,品牌:國藥集團化學試劑有限公司,批號:20171011。

儀器:勻漿機,品牌:OMNI,型號:19-2241E;離心機,品牌Thermo,型號:X1R;真空冷凍干燥機,品牌:LABCONCO,型號:FREEZONE 4.5;電泳儀,品牌:BIO-RAD,型號:Model 3000i;溫度計,品牌:SENSI TECH,序列號:FKS1100KYO,校準日期:2018年 12 月 6 日。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本的制備

依據國家標準GB/T14927.1-2008 實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標記檢測法進行血清樣本取樣,凍干樣本制備和穩定性檢驗。 CNAS(China National Accreditation Service for Conformity Assessment)文件 CNAS-CL04 ∶2010 要求,應評定標準物質/標準樣品的穩定性,確定樣品的穩定程度與目的相符。 針對血清樣本的特點和能力驗證計劃的特點,設計樣本穩定性檢驗方案。 以時間為函數評估溫度對樣本的影響。 本計劃中的血清樣本按照CNAS 的能力驗證和標準物質相關文件要求完成樣本的制備和均勻性檢驗穩定性檢驗[3-11]。

1.3.2 保藏穩定性檢驗

樣本制備完成后到發出之前,預計有3 ～6 個月的時間,需保存在低溫條件下,以保證樣本的穩定性。 方案中選擇-20℃和4℃兩個溫度條件,保存50 d 后,進行穩定性檢驗。

1.3.3 加速穩定性檢驗

樣本在運輸過程中或者檢測過程中有可能暴露在較高溫度條件下。 方案中選擇室溫(實際檢測溫度為19.5℃～21.5℃)和37℃兩個溫度條件,分別在 1、2、3、24、25、26、27 d,進行穩定性檢驗。

1.3.4 運輸穩定性檢驗

應對標準物質/標準樣品在運輸條件下的穩定性進行評估[4]。 模擬實際運輸條件:干冰,冰袋和泡沫箱。 選擇廣州,杭州和烏魯木齊,三個地點,快遞發出樣本,回收樣本后,進行運輸穩定性檢驗。

1.3.5 最終穩定性驗證

在能力驗證計劃全部實施完成后,選取保存在-20℃條件下的2 份小鼠血清樣本,進行穩定性驗證。

2 結果

2.1 保藏穩定性和加速穩定性結果

分別將樣品放置在 37℃、室溫(19.5℃ ～21.5℃)、4℃和-20℃條件下,檢測結果表明:酯酶-1 在37℃條件下,可以穩定至27 d。 酯酶-1 在室溫(19.5℃～21.5℃)條件下,可以穩定至 27 d。 酯酶-1 在 4℃條件下,可以穩定至 50 d。 酯酶-1 在-20℃條件下,可以穩定至50 d。 具體檢測結果詳見表1、圖1、圖2、圖3。

保藏穩定性檢驗結果表明,樣本在-20℃和4℃條件下,可以穩定保存50 d;室溫(19.5℃～21.5℃)條件下,可以穩定保存27 d;37℃條件下,酯酶-1 樣本可以穩定保存27 d。

2.2 運輸穩定性結果

模擬運輸條件,泡沫保溫箱,干冰制冷,保溫箱內放一個校準合格的電子溫度計,記錄保溫箱內運輸過程中的溫度。 選擇有代表性的3 個目的地:廣州,杭州和烏魯木齊,EMS 快遞,發出-收回樣本后,進行運輸穩定性檢驗。 發往廣州的樣本經過7 d 返回北京,經歷最高溫度為20.2℃,樣本依然穩定;發往杭州的樣本經過3 d 返回北京,經歷最高溫度為0.1℃,樣本依然穩定;發往烏魯木齊的樣本經過14 d 返回北京,經歷最高溫度為14.5℃,樣本依然穩定。 具體結果詳見表2、圖4、圖5、圖6 和圖7。

2.3 最終穩定性驗證

本年度能力驗證計劃實施完成后,對剩余樣本(保存于-20℃)進行穩定性檢驗。 取2 份 B6 樣本和2 份CB 樣本,酯酶-1 結果表明樣本依然穩定,如圖8 所示。

表1 樣品保藏穩定性和加速穩定性檢驗結果Table 1 Testing results of sample storage stability and acceleration stability

注:圖A:1:標準b;2:1 d(B6);3:2 d(B6);4:3 d(B6);5:標準a;6:標準b;7:1 d (CB);8:2 d(CB);9:3 d(CB);10:標準a。圖B:1:27 d(B6);2:27 d(B6);3:26 d(B6);4:26 d(B6);5:標準a;6:標準b;7:25 d(B6);8:25 d(B6);9:24 d(B6);10:24 d(B6)。圖C:1:27 d(CB);2:27 d(CB);3:26 d(CB);4:26 d(CB);5:標準a;6:標準b;7:25 d(CB);8:25 d(CB);9:24 d(CB);10:24 d(CB)。圖1 在室溫(19.5℃～21.5℃)條件下酯酶-1 穩定性檢驗結果Note.Figure A,1, Marker b; 2,1 d(B6);3,2 d(B6);4,3 d(B6);5, Marker a;6, Marker b;7,1 d(CB);8, 2 d(CB);9, 3 d(CB); 10, Marker a.Figure B,1,27 d(B6);2,27 d(B6);3,26 d(B6);4,26 d(B6),5, Marker a;6, Marker b;7,25 d(B6);8,25 d(B6);9, 24 d(B6); 10, 24 d(B6).Figure C,1,27 d(CB);2,27 d(CB);3,26 d(CB);4,26 d(CB);5,Marker a;6,Marker b;7,25 d(CB);8,25 d(CB);9, 24 d(CB); 10, 24 d(CB).Figure 1 Testing results of the stability of esterase-1 at room temperature

注:圖D:1:標準b;2:1 d(B6);3:2 d(B6);4:3 d(B6);5:標準a;6:標準b;7:1 d(CB);8:2 d(CB);9:3 d(CB);10:標準a。圖E:1:27 d(B6);2:27 d(B6);3:26 d(B6);4:26 d(B6);5:標準a;6:標準b;7:25 d(B6);8:25 d(B6);9:24 d(B6);10:24 d(B6)。圖F:1:27 d(CB);2:27 d(CB);3:26 d(CB);4:26 d(CB);5:標準a;6:標準b;7:25 d(CB);8:25 d(CB);9:24 d(CB);10:24 d(CB)。圖2 在37℃條件下酯酶-1 穩定性檢驗結果Note.Figure D, 1, Marker b; 2, 1 d(B6);3,2 d(B6); 4,3 d(B6);5, Marker a;6, Marker b;7,1 d(CB);8,2 d(CB);9, 3 d(CB); 10, Marker a.Figure E, 1, 27 d(B6); 2,27 d(B6);3,26 d(B6);4,26 d(B6);5, Marker a;6, Marker b;7,25 d(B6);8,25 d(B6);9, 24 d(B6); 10, 24 d(B6).Figure F, 1, 27 d(CB);2,27 d(CB);3,26 d(CB);4,26 d(CB);5,Marker a;6,Marker b;7,25 d(CB);8,25 d(CB);9, 24 d(CB); 10, 24 d(CB).Figure 2 Testing results of the stability of esterase -1 at 37℃

表2 樣品運輸穩定性檢驗結果Table 2 Testing results of sample transportation stability

注:1:B6(4℃);2:B6(4℃);3:CB(4℃);4:CB(4℃);5:標準a;6:標準 b;7:B6(-20℃);8:B6(-20℃);9:CB(-20℃);10:CB(-20℃)。圖3 酯酶-1 50 d 穩定性檢驗結果Note.1, B6(4℃); 2, B6(4℃); 3, CB(4℃); 4, CB(4℃); 5, Marker a; 6, Marker b; 7, B6(-20℃); 8, B6(-20℃); 9, CB(-20℃); 10, CB(-20℃).Figure 3 Testing results of the stability of esterase-1 and transferrin at 50 d

3 討論

3.1 保藏穩定性對于能力驗證樣品的重要性

文件CNAS-CL04 要求,應評估各種貯存條件對候選標準物質/標準樣品特性的影響[4]。 本研究考察4 個溫度的貯存條件對標準樣品的影響,主要基于以下幾方面的考慮:1,樣本在不使用的情況下通常保存在低溫條件下,而且保存時間較長,比如樣本制備完成后,發放給參加實驗室之前。 選擇4℃和-20℃作為長期穩定性考察點。 2,樣本在運輸過程中或者使用過程中有可能經歷較高溫度,但是這個時期不會很長,選擇37℃和室溫作為短期穩定性/加速穩定性考察點。 3,能力驗證計劃對于參加實驗室收到樣本后,反饋實驗結果的時限有一定的要求,通常是10 個工作日,即使實驗室沒有第一時間開展實驗,樣本保存的時間也不會太長。 長期穩定性考察50 d,短期穩定性考察27 d。 該流程的設置滿足能力驗證計劃實施的需求。 國家標準GB/T14927.1-2008 實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標記檢測法中有14 個生化標記位點,該14 個位點對溫度的敏感度差異懸殊,實驗結果表明酯酶-1 是其中最為穩定的一個位點,酯酶-1 是能力驗證計劃的理想檢測項目[12-13]。

注:圖G(廣州):1:B6;2:B6;3:CB;4:CB;5:標準 a;6:標準 b;7:B6;8:B6;9:CB;10:CB。 圖H:1:B6 (杭州);2:B6(杭州);3:CB(杭州);4:CB(杭州);5:標準a;6:標準b;7:B6 (烏市);8:B6 (烏市);9:CB (烏市);10:CB (烏市)。圖4 酯酶1 運輸穩定性檢驗Note.Figure G(Guangzhou), 1, B6; 2, B6; 3, CB;4, CB;5, Marker a; 6, Marker b;7, B6;8, B6;9, CB;10, CB.Figure H, 1, B6(Hangzhou); 2, B6(Hangzhou);3, CB(Hangzhou);4, CB(Hangzhou);5, Marker a;6, Marker b;7,B6(Wulumuqi); 8, B6(Wulumuqi); 9, CB(Wulumuqi); 10, CB(Wulumuqi).Figure 4 Testing results of esterase -1 transportation stability

圖5 北京-廣州-北京溫度曲線圖(最高溫度20.2℃)Figure 5 Beijing-Guangzhou-Beijing temperature curve(The highest temperature is 20.2℃)

圖6 北京-杭州-北京溫度曲線圖(最高溫度0.1℃)Figure 6 Beijing-Hangzhou-Beijing temperature curve(The highest temperature is 0.1℃)

3.2 能力驗證樣品的運輸穩定性

圖7 北京-烏魯木齊-北京溫度曲線圖(最高溫度14.5℃)Figure 7 Beijing-Wulumuqi-Beijing temperature curve(The highest temperature is 14.5℃)

注:1:B6(1);2:CB(1);3:B6(2);4:CB(2);5:標準 a;6:標準b;7:CB(1);8:B6(1);9:CB(2);10:B6(2)。圖8 酯酶-1 最終穩定性驗證Note.1, B6(1); 2, CB(1);3, B6(2);4, CB(2);5, Marker a;6, Marker b; 7, CB(1); 8, B6(1); 9, CB(2); 10, B6(2).Figure 8 Final stability verification of Es-1

應對標準物質/標準樣品在運輸條件下的穩定性進行評估[4]。 需要說明的是,只有證明充分均勻之后才能進行穩定性檢驗。 該樣品已經過均勻性檢驗,在本文中不做討論。 在運輸過程中有很多不可控的因素:停留時間,包裝氣密性對干冰揮發速度的影響,接收樣本的單位與發出單位的距離等方面,都有可能影響樣本的穩定性。 本研究中模擬實際運輸條件,考察樣本的穩定性。 樣本的發出地為北京,選擇3 個具有代表性的城市:杭州,廣州,烏魯木齊,作為運輸穩定性的目的城市。 從樣本發出到返回,分別經歷了3 d,7 d 和14 d,樣本依然穩定。發往廣州的樣本經過7 d 返回北京,經歷最高溫度為20.2℃,樣本依然穩定;發往杭州的樣本經過3 d返回北京,經歷最高溫度為0.1℃,樣本依然穩定;發往烏魯木齊的樣本經過14 d 返回北京,經歷最高溫度為14.5℃,樣本依然穩定。 研究結果表明,運輸條件能夠保證該樣本的穩定性。

3.3 能力驗證計劃完成后樣本的穩定性驗證

本次能力驗證計劃的樣本依據標準物質相關要求完成樣本的均勻性檢驗和穩定性檢驗,同時滿足能力驗證和標準物質的雙重要求。 能力驗證計劃實施完成后,剩余的標準樣本可用于后續測量審核活動和新一輪能力驗證計劃的開展。 為保證樣本能夠繼續適用于測量審核和能力驗證,CNASCL04 要求,穩定性評估應在測定之后定期進行[4]。因此,有必要制定穩定性評估的標準操作規程,定期實施穩定性評估計劃,保證標準樣本的穩定性,留存相關記錄備查。 定期進行穩定性評估能夠保證標準樣本的充分利用。

3.4 穩定性信息應及時告知參加實驗室

CNAS-CL04 要求,穩定程度應在伴隨標準物質/標準樣品的文件中表明,生產者應將有效期的變化及使用的可能后果告知客戶[4]。 測量值沒有必要向客戶公布,但是樣本的穩定程度,有效期及可能后果,應告知客戶。 保證客戶在使用樣本過程中實施安全操作,最大程度避免由于操作不當影響樣本的穩定性[14-15]。

綜上所述,研究結果表明酯酶-1 血清樣本可以作為標準樣本用于能力驗證,測量審核,以及作為標準物質在實驗動物質量控制領域廣泛應用。 該樣本的穩定性能夠滿足能力驗證計劃的實施要求,是開展能力驗證計劃的理想樣本。 能力驗證樣本的標準化和穩定性研究對于能力驗證計劃的實施至關重要[16-20]。