c-Myc、RhoA、YAP 在腺嘌呤誘發慢性腎病中的表達意義

文 莉何 濤康 婷熊 琳朱婷婷歐三桃?

(1.西南醫科大學附屬醫院腎病內科,四川瀘州 646000; 2.四川省腎臟疾病臨床醫學研究中心,四川瀘州 646000)

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)是一種嚴重危害人類健康的常見的慢性疾病,而腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是各種腎疾病進展到終末期的共同途徑和主要病理學特征之一[1]。 CKD 進展過程中,腎小管上皮細胞和腎間質成纖維細胞可以轉化為肌成纖維細胞,進而合成和分泌大量細胞外基質促使腎小管間質纖維化[2-3]。腎小管間質纖維化程度可以反映腎功能下降嚴重程度,并可作為判斷患者預后最重要的指標之一[4],了解其發病機制對指導治療十分重要。

腎間質纖維化病變機制復雜,受多種細胞因子和多條信號通路的調控,目前研究較多的是TGF-β/Smad3、JAK/STAT 和 PI-3 K 通路等[5-6]。過去關于c-Myc、RhoA 和YAP 的研究多集中在腫瘤的發生發展領域,但是近年來也有研究發現,c-Myc 和RhoA 均具有促纖維化作用[7-8],YAP 的持續過度活化也可促進腎間質纖維化的發生[9-10],但關于三者在慢性腎病腎間質纖維化模型中的表達情況,以及其與腎間質纖維化的相關關系尚無報道。 RhoA-YAP 信號軸可促進多囊腎(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD) 的發展,而c-Myc-YAP 相互作用可促進腫瘤進展,故推測在慢性腎病腎間質纖維化方面,c-Myc-RhoAYAP 之間可能也存在一定聯系進而加速腎纖維化進程。 因此,本研究主要觀察c-Myc、RhoA 和YAP在腺嘌呤誘發慢性腎病大鼠腎小管間質纖維化中的表達情況,并分析其與腎小管間質纖維化之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 30 只,體重(200±10) g,8周齡,購自西南醫科大學實驗動物中心[SCXK(川)2018-17]。 于西南醫科大學附屬中醫醫院中西醫結合研究中心動物房飼養并取材[SYXK(川)2018-065]。 本實驗經西南醫科大學實驗動物倫理委員會審批(20180306114),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(貨號V900471,批號XWBC5614 V,規格100 g,Sigma 公司,美國);天狼星紅染色液(批號:19.09,貨號:BM1403-2×50 mL,規格 2×50 mL,合肥博美公司);RhoA 抗體、c-Myc 抗體、α-SMA 抗體(批號分別為:00048176、00060703、00070177,貨號分別為:10749-1-AP、10828-1-AP、14395-1-AP,規格:50 μL,武漢三鷹公司);YAP 抗體(貨號:BS1701,規格:50 μL,bioworld 公司,美國);Col1 抗體(貨號:XS20180914013,bioworld 公司,美國);即用型ABC 試劑盒(bioworld 公司,美國),DAB 顯色試劑盒(貨號:c02-04001,武漢博士德公司);熒光定量PCR 試劑盒(Thermo scientific,美國),上下游引物:c-Myc、RhoA、YAP、Vimentin、Col1、α-SMA、GAPDH 均購自上海生物工程有限公司。

高速冷凍離心機(Eppendorf 公司,德國);全自動生化分析儀(西門子,德國);石蠟切片機(Thermo公司,美國);光學顯微鏡(Nikon 公司,日本);POLYTRON?臺式勻漿機(Kinematica 公司,瑞士);逆轉錄儀(Eppendorf 公司,德國);實時熒光定量 PCR 儀(Eppendorf 公司,德國)

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模

30 只8 周齡雄性SD 大鼠適應性喂養1 周,大鼠依次編號后隨機將編號進行分組,分為對照組(n=15)和模型組(n=15)。 腺嘌呤溶于蒸餾水,制成2.5%混懸液,CKD 組第1 ～4 周每日定時給予腺嘌呤混懸液 250 mg/(kg·d)灌胃,第 5 ～8 周腺嘌呤混懸液200 mg/(kg·d)隔日灌胃;對照組給予等體積生理鹽水灌胃,兩組均予以普通飼料喂養。 所有大鼠自由進食及飲水,光照時間明暗各半,室溫18℃～25℃。

1.3.2 標本采集

分別于第4、6、8 周末處死大鼠,經腹主動脈采血,測定腎功(血清尿素氮BUN、肌酐 SCr、胱抑素CysC);留取24 h 尿液做24 h 尿蛋白定量(24 h Pro)檢測;留取腎組織置于10%中性福爾馬林液中固定,制成石蠟切片,另一部分腎組織凍存于-80℃冰箱中用。

1.3.3 HE 染色觀察腎病理改變

取大鼠腎組織石蠟塊切片(4 μm),常規脫蠟,至水后蘇木精液染色、透明、封片,觀察腎病理改變,包括腎小球、腎小管和腎間質等,重點觀察小管間質情況。 參考Radford 等[11]腎間質損傷的評分標準,每張標本隨機選取皮質區的10 個不含腎小球的非重復視野(×200),根據以下8 個參數判定腎小管間質損傷情況(腎小管上皮細胞空泡變性、壞死;腎小管擴張;小管萎縮;紅細胞管型;蛋白管型;間質水腫;間質細胞浸潤;間質纖維化程度),具體評分細則見表1。 每個視野小管間質評分 0 ～24 分,以10 個視野的均值作為該標本的腎間損傷指數。

1.3.4 天狼星紅染色觀察腎間質纖維化

腎組織固定,常規脫水包埋,切片,常規脫蠟至水;天狼星紅染色液滴染1 h;流水稍微沖洗,去除切片表面染液;Mayer 蘇木素染色液染細胞核5 ～8 min;流水沖洗10 min;常規脫水透明,中性樹膠封固、觀察。

參照膠原纖維相對面積的評定方法[12],評估天狼星紅染色膠原纖維沉積情況:每例切片選取10 個非重復視野(×200),以紅色染色為陽性表達。 著色面積評分標準:每個視野中,無損傷,間質纖維化少于皮質區5%=0 分;輕度損傷,間質纖維化占皮質區的6%～25%=1 分;中度損傷,間質纖維化占皮質區26%～50%=2 分;中度損傷,間質纖維化大于皮質區50%=3 分。 把10 個視野總分值求和后取平均值,得到該切片的纖維化程度評分。

1.3.5 免疫組化檢測大鼠腎組織 c-Myc、RhoA、YAP、Col1、α-SMA 蛋白表達

腎組織石蠟切片經脫蠟至水處理后,按照ABC法依次行熱修復抗原,3% H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min,山羊血清封閉非特異抗原,滴加一抗、二抗、ABC 復合物、DAB 顯色液,蘇木素復染,常規脫水、透明、中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,出現棕黃色顆粒為陽性信號。

表1 腎小管間質損傷指數評分標準Table 1 Scoring criteria of renal tubulointerstitial injury

1.3.6 RT-PC 檢測 c-Myc、RhoA、YAP、Col1、α-SMA、Vimentin mRNA 水平

根據試劑盒說明書提取腎組織總RNA,再用逆轉錄試劑盒將mRNA 反轉錄為cDNA。 再采用PCR 儀進行PCR 反應,擴增條件為:95℃預變性10 min,40 個循環(95℃ 5 s,55℃ 15 s,72℃ 30 s)。 實時記錄cDNA 的擴增,然后進行常規溶解曲線分析。 依據樣本PCR 反應的CT 值,以2-△△CT表示目的基因的相對表達量。

引物序列:c-Myc 上游:5’-TTCTATCACCAG CAACAGCAGAGC-3’ 下 游: 5’-CGTAGCGACCGC AACATAGGAC-3’; RhoA 上 游: 5’-GCTTGTGGT AAGACATGCTTGCTC-3’ 下 游: 5’-GGCCTCAGA CGGTCATAATCTTCC-3 ’; YAP 上 游: 5 ’-GCCATGAACCAGAGGATCACTCAG-3’ 下 游: 5’-AGCCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3’; Col-1 上 游:5’-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3’ 下游:5’-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC-3’;α-SMA 上游:5’-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC-3’ 下游:5’-CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3’; Vimentin 上游:5’-GTCCGTGTCCTCGTCCTCCTAC-3’ 下游:5’-TAGAGGCTGCGGCTAGTGCTG-3’。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析,符合正態分布的計量資料采用平均數±標準差(±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,兩變量間的相關性分析用Pearson檢驗,以P<0.05 為有統計學差異。

2 結果

2.1 兩組大鼠不同時間點血、尿指標情況

與對照組比較,CKD 組各時間點血BUN、Scr、CysC 均明顯升高,CKD 組大鼠24 hPro 水平從 6 周開始較對照組升高,差異有統計學意義(P<0.01;圖1)。

2.2 大鼠腎組織HE 染色和腎間質損傷評分情況

HE 染色結果:對照組大鼠整體腎組織結構清晰,皮、髓質分界清楚,腎小球、腎小管和腎間質的形態結構均無明顯異常;CKD 組腎組織:第4 周末可見腎小管擴張,以近端小管為主,管腔內可見棕褐色物質沉積;第6 周末可見遠端腎小管和腎小球囊腔擴張;第8 周末,腎組織結構紊亂,腎小球部分萎縮,腎小管擴張明顯,小管上皮細胞變性壞死,有較多炎細胞浸潤(圖2)。

與對照組比較,CKD 組大鼠腎間質損傷評分明顯增高(P<0.01),且腎間質損傷評分隨時間延長而逐漸升高,CKD 組6 周腎間質損傷評分較4 周有所增加,但差異無統計學意義;CKD 8 周較6 周腎間質損傷評分顯著增高,差異具有統計學意義(P<0.05;圖3)。

注:與 CKD 組比較,#P<0.05;與 Con 組比較,??P<0.01。圖1 兩組大鼠不同時間點血、尿生化指標變化Note.Compared with the CKD group, #P<0.05.Compared with the Con group, ??P<0.01.Figure 1 Changes of blood and urine biochemical indexes in the two groups of rats at different time points

圖2 兩組大鼠腎組織HE 染色Figure 2 HE staining of renal tissue in two groups of rats

注:與CKD 組前一時間點比較,#P <0.05;與Con 組同一時間點比較,??P <0.01圖3 腎間質損傷評分Note.Compared with the previous time point of CKD group, #P <0.05.Compared with the same time point of Con group, ??P <0.01.Figure 3 Renal interstitial injury score

2.3 大鼠腎組織天狼星紅染色情況及腎間質纖維化評估

天狼星紅染色結果可見:對照組大鼠腎組織無明顯膠原纖維沉積;CKD 組自第4 周開始可見腎間質少許淡紅色膠原纖維沉積;隨著造模時間的延長,CKD組6 周時腎間質紅染膠原纖維較前增多,8 周時可見腎間質有大量淡紅色膠原纖維沉積(圖4)。 天狼星紅染色半定量評分結果顯示,自第6 周開始腎間質膠原面積較對照組明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05;圖5),而CKD 組不同時間點膠原面積雖然是逐漸增加的,但差異并無統計學意義。

2.4 兩組大鼠腎組織免疫組化染色結果

對照組大鼠腎組織中RhoA 和c-Myc 在腎小球和腎小管細胞胞核中幾乎不表達;而CKD 大鼠腎小球細胞胞核可出現RhoA 和c-Myc 表達,而腎小管細胞胞核中表達較對照組均明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05),但各時間點之間無明顯差異。對照組大鼠腎小球細胞無YAP 表達,腎小管細胞胞質中僅有YAP 少量表達;CKD 大鼠腎小球細胞核中也有少量YAP 表達,第4 周和6 周腎小管細胞胞質和胞核中YAP 表達均有所增加,但差異無統計學意義;第8 周 CKD 大鼠腎小管細胞胞質和胞核中YAP 表達明顯增加,且差異具有統計學意義(P<0.05),以胞核表達增加更為顯著。 另外,對照組大鼠腎間質中幾乎不表達Col1 和α-SMA,但在CKD大鼠中腎間質Col1 和α-SMA 表達明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05),且 CKD 大鼠腎小球Col1 表達也明顯增加,見圖6。

2.5 大鼠腎組織 c-Myc、RohA、YAP、Col1、α-SMA和 Vimentin 的 RT-PCR 結果

RT-PCR 結果顯示:CKD 組大鼠腎組織各時間點 c-Myc、 RohA、 YAP、 Col1、 α-SMA 和VimentinmRNA 表達量均較對照組顯著增高,差異均有統計學意義(P<0.05;圖7)。

2.6 相關性分析

c-Myc、RhoA 和 YAP mRNA 表 達 與 α-SMA mRNA 表達水平均呈顯著正相關關系(r=0.818,P=0.004;r=0.77,P=0.009;r=0.83,P=0.003),與Col1mRNA 的表達水平也呈明顯正相關(r=0.988P=0.000;r=0.745P=0.013;r=0.927P=0.000),表明 RhoA、YAP 和 c-Myc 表達與腎纖維化程度密切相關。 為了進一步探討這三者之間的關系,進行 c-Myc、YAP 與 RhoA 相關性的分析,結果顯示:YAP 與 RhoA、c-Myc 與 RhoA 之間同樣存在著明顯的正相關關系(r= 0.661P= 0.038;r=0.721P=0.019;圖8)

圖4 大鼠腎組織天狼星紅染色Figure 4 Sirius red staining of rat kidney tissue

注:與 Con 組同一時間點比較,??P <0.01。圖5 天狼星紅染色膠原面積半定量評分Note.Compared with the same time point of Con group, ??P<0.01.Figure 5 Semi-quantitative scoring of collagen area by Sirius red staining

3 討論

腎小管間質纖維化是終末期腎疾病的主要病變之一,主要表現為腎損傷后過量的細胞外基質(ECM)的合成和聚集,其病變機制復雜,可受多種細胞因子和信號通路的調控。 近年來有學者提出Hippo 信號通路在腎間質纖維化過程中扮演著重要角色,其中 YAP 是關鍵因素。 c-Myc、RhoA 與 YAP在腫瘤的發生發展過程中存在著聯系,也有研究表明他們可能參與腎纖維化進程,但關于這三者在慢性腎病腎小管的表達情況及其與腎間質纖維化之間的關系尚未開展研究。 腎纖維化動物模型造模方法眾多,包括藥物或毒物誘導、手術以及基因敲除等[13]。 在本研究中,我們選用腺嘌呤誘發的大鼠慢性腎病腎纖維化模型,通過檢測尿素氮、肌酐、胱抑素C 和24 h 尿蛋白定量等腎損傷的指標,再結合腎組織HE 染色結果等證實CKD 動物造模成功;天狼星紅染色顯示模型大鼠腎間質出現明顯淡紅色膠原纖維沉積,α-SMA、Col1 和 Vimentin 纖維化相關標志物的mRNA 水平較對照組明顯增加,證實腺嘌呤誘發慢性腎病的大鼠出現了腎小管間質的纖維化,且隨時間延長逐漸加重。 腎纖維化的分子機制較為復雜,其中腎小管上皮細胞的損傷、修復功能障礙是導致腎纖維化的重要機制之一[14]。 因此,本研究的研究重點主要是在腎小管間質部分。

c-Myc 是Myc 家族中最重要的成員,作為一種原癌基因,它可以刺激細胞過度生長和增加新陳代謝[15-16]。 Kim 等[17]發現在腫瘤細胞中,c-Myc 的表達激活可導致RhoA 表達增加,而c-Myc 的缺失可導致RhoA 的缺失。 在我們的研究中,c-Myc 在腺嘌呤誘發慢性腎病大鼠的腎小管細胞胞核中高表達,其mRNA 相對表達量與纖維化相關因子呈明顯正相關,且c-Myc 和RhoA mRNA 之間也存在著明顯的正相關關系,提示腎間質纖維化進程中也可能存在c-Myc-RhoA 信號軸的激活,該過程可能還伴有TGF-β 信號通路的活化[18],但具體機制還有待進一步的研究。

RhoA 是RhoA-GTP 酶的家族成員之一,它的表達受 c-Myc、HIF-1α/2α、Stat 6 和 NF-κB 等幾種microRNA 的調控[19],又可調控YAP 活性,但 YAP的激活又可誘導ARHGAP29 轉錄從而抑制RhoA活性[20]。 在我們的研究中,RhoA 和YAP 在腺嘌呤誘發CKD 大鼠腎小管細胞胞核中均高表達,且mRNA 相對表達量與 α-SMA、Col1mRNA 的相對表達量均呈明顯正相關關系,表明二者可能參與了腎小管間質纖維化進程,且可能是通過RhoA 轉錄調控YAP 活性而實現的。

注:與CKD 組前一時間點比較,#P<0.05;與Con 組同一時間點比較,?P<0.05,??P<0.01。圖7 mRNA 相對表達量Note.Compared with the previous time point of CKD group, #P <0.05.Compared with the same time point of Con group, ?P<0.05, ??P<0.01.Figure 7 Relative mRNA expression

圖8 相關性分析Figure 8 Correlation analysis

目前針對YAP 在腎損傷中所扮演的角色尚無統一定論。 Leach 等[21]人認為,在缺血損傷的心肌細胞中抑制YAP 活性,可以促使心肌細胞再生并改善心功能,并認為這可能同樣適用于腎損傷及其修復。 但也有人認為,心臟特異YAP 的表達缺失會阻礙心肌再生,導致心肌纖維化[22]。 我們的研究結果顯示,在腺嘌呤誘發的CKD 大鼠模型中,YAP 在腎小管細胞胞核中的表達量是明顯增加的,YAP mRNA 表達量較對照組也明顯增加,8 周末達到最高。 將8 周末YAP mRNA 表達水平與纖維化標志物α-SMA 和Col1mRNA 的表達水平進行相關性分析,結果顯示YAP mRNA 表達量與纖維化標志物mRNA 呈明顯正相關關系,表明在慢性腎病中YAP的表達活化可能促進腎間質纖維化。 但需要注意的是,YAP 在腎小管上皮細胞中的早期表達可能是幫助AKI 所致腎小管損傷修復的[23],但當其表達超過某一界限值則可導致腎間質纖維化的發生,因此如何界定其界限范圍尚有待更進一步的研究。

綜上所述,c-Myc、RhoA、YAP 在腺嘌呤誘發CKD 大鼠的表達可能促進了腎小管間質纖維化過程。 此外,RhoA 和 c-Myc、YAP 之間也存在正相關關系,推測RhoA 可能是聯系c-Myc 和YAP 的橋梁,調控c-Myc-RhoA-YAP 信號軸的活化可能延緩腎間質纖維化進程,但具體的機制有待進一步深入研究證實。