基于高通量測序分析紫貽貝凍藏過程中菌群組成變化

蔣慧麗 水珊珊 吳瓊靜 陳曉楠 張 賓 蘇來金

(1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.溫州市農業科學研究院溫州市特色食品資源工程技術研究中心，浙江 溫州 325006)

紫貽貝(Mytilusedulis)肉質肥美、營養豐富，在中國大部分產自渤海灣、黃海和東海沿岸地區，其中資源最為豐富的地區為浙江嵊泗列島附近海域，嵊泗枸杞島素有“貽貝之鄉”的美稱[1]。近年來，海鮮食品已成為人們餐桌上獲得蛋白質的日常選擇，其中紫貽貝深受廣大消費者的喜愛。但紫貽貝由于產量大、采收期集中，加上捕后貯藏不當、微生物侵襲等因素，極易損害貝肉品質，造成營養和食用價值降低。其中，微生物侵襲及污染是影響紫貽貝及其制品品質的重要原因之一。另外生長水質、捕后貯運方式及加工環境等，也會影響紫貽貝制品中菌群組成及其豐度變化[2][3]17。據廣東省動物性水產品微生物污染調查研究[4]發現，2017—2019年廣東省部分地區蝦、蟹、貽貝類中致病菌陽性檢出水平超過半數。趙金麗等[5]研究發現，不同紫貽貝制品中的微生物組成情況不同；新鮮和自制紫貽貝干的微生物中，占比較大的是不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬，而市售紫貽貝干產品中優勢菌為腸球菌屬和葡萄球菌屬。不同狀態下的紫貽貝樣品的菌群組成均存在較大差異，關于紫貽貝肉凍藏過程中優勢菌組成及其豐度變化情況還尚未見報道。

以往研究人員通常采用傳統分離培養的方法來獲取食品表面菌群信息，選取合適的樣品稀釋液涂布于各類平板上進行分離、純化及鑒定，但該方法耗時長，人工成本高，且獲取的菌群信息尚不準確。此外，采用傳統分離方式培養得到的菌群信息較少，同時存在較大偏差。伴隨科技的進步，現代基因測序技術已能夠滿足通量強、成本低、深度高和檢測快速的需求，其中高通量測序技術作為一種分子生物學方法，可以實現一次檢測大量樣本，每次運行可產出幾十千兆字節，甚至幾百千兆字節的數據分析量，目前已被廣泛應用于食品、養殖、生物醫藥等各個領域[6-7]。該技術將待測樣品的全部基因進行提取分析，能夠全面地反映菌群特征，兼具安全性高、誤差小、分析全面等優勢[8]。目前，已有多篇高通量測序技術應用于水產品微生物組成分析的報道，檢測對象包括牡蠣[9]、南美白對蝦[10-11]、蟹糊[12]、小龍蝦[13]等，而利用該技術方法剖析凍藏過程中紫貽貝的細菌菌群結構變化情況的相關研究還鮮見報道。基于此，研究擬應用高通量測序技術，從基因水平層面全面揭示不同凍藏時間的紫貽貝肉中菌群的多樣性和群落結構的動態變化情況，結合近期研究成果剖析其優勢菌群的形成原因和發展趨勢，為解決紫貽貝及其制品的貯藏品質問題提供基礎理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

活體紫貽貝樣品：殼(10.0±0.5) cm，殼寬(2.5±0.5) cm，殼高(5.1±0.5) cm，質量(50.0±3.0) g，運至實驗室后，立即進行試驗，浙江省舟山市東河市場。

1.2 試劑與儀器

TransStart FastPfu DNA Polymerase等測序試劑：化學純，美國Illumina公司；

AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；

PCR儀：ABI GeneAmp?9700型，美國ABI公司；

藍色熒光定量系統：QuantiFluorTM-ST 型，美國Promega公司。

1.3 樣品處理與分組

鮮活的紫貽貝蒸汽處理2 min，開殼后解剖取出完整的紫貽貝肉樣品，無菌紗布輕拭去表面水分，裝入無菌袋中，參考呂丹丹[3]17-25的研究，根據凍藏期間理化指標變化節點，將紫貽貝肉分為：新鮮紫貽貝肉組(FS)、凍藏1周紫貽貝肉組(FS-1)、凍藏3周紫貽貝肉組(FS-3)和凍藏9周紫貽貝肉組(FS-9)。將以上各組樣品置于-18 ℃冰箱中凍藏，分別在解剖即時和凍藏1，3，9周時取樣測定。

1.4 貝肉表面微生物提取

向各組紫貽貝肉加入無菌生理鹽水，配置成m紫貽貝∶V生理鹽水=1∶9 (g/mL)的濁液，每組設置3個平行組，置于360 r/min下提取1 h，將表面微生物提取到生理鹽水中，過濾，無菌水淋洗；然后將濾液10 000 r/min離心25 min，對獲得的下層沉淀物進行微生物組成分析[14]。

1.5 微生物群落分析

根據趙金麗等[5]的方法進行高通量測序，從而進行生物學信息分析。

1.6 貝肉微生物信息分析

將測序得到的PE reads進行拼接，并對所得序列進行質控和過濾質量[15]，再進行操作分類單元(Operational taxonomic units，OTU)聚類分析和物種分類學分析。最后進行多樣性分析和主成分分析。基于物種分類學信息利用軟件繪制出各試驗組的群落柱形圖和豐度聚類熱圖[5,16]。

1.7 數據處理

選擇MiSeq測序平臺進行數據分析，用FLASH對各試驗組樣品的reads進行拼接。基于相似性為97%的范圍使用Uparse軟件(v7.0.1001)進行OTU聚類分析。測序獲得的基因序列與Silva數據庫進行比對。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計

基于97%相似水平下，對各樣品序列信息進行聚類分析并統計得知，樣品的有效序列區間為31 896～42 812條，平均長度區間為441.83～453.62 bp(表1)。統計各試驗組OTU生物信息發現，OTU區間為289～681，新鮮紫貽貝肉OTU數量最高為681，其余3組紫貽貝肉的OTU數量依次為623，504，289。

2.2 Rank-Abundance曲線

Rank-Abundance曲線能夠反映微生物的豐富度和均勻度。曲線越寬樣品的物種豐度越高，曲線越平滑樣品的均勻度越大[17]。分析結果可知，新鮮紫貽貝肉和凍藏1周紫貽貝肉的曲線較寬，而凍藏3周紫貽貝肉曲線寬度最小(圖1)，說明了前兩組的紫貽貝肉中微生物的豐度很高。由于低溫環境會抑制不耐冷微生物的生長繁殖，因此凍藏后期豐度降低。與新鮮樣本和凍藏1周樣本的曲線相比，凍藏3周和凍藏9周樣本的曲線相對陡峭，說明凍藏3周和凍藏9周紫貽貝肉中的微生物分布不均勻，原因可能是凍藏后期貝肉表面聚集了對低溫耐受性較高的微生物，致使貝肉中微生物的分布不均勻[18]。結果可知，由于長時間的低溫脅迫，紫貽貝肉微生物豐度和分布均勻性降低。

表1 樣品信息統計表Table 1 Sample information statistics

2.3 稀釋曲線和Shannon-Wiener曲線

稀釋曲線能夠反映測序數據是否合理。由圖2可知，當測序深度>25 000時，所有樣品曲線上點的斜率均已趨于零，表示再擴大數據量也不會測出更多新微生物物種[19]，說明該樣本測序深度科學，樣本中大多數的微生物物種能夠被反映出來[20]。Shannon-Wiener曲線中各點的值愈大，群落所含的信息量愈大，能夠反映測量序列的多樣性。由圖3可知，前兩組樣本菌群更多樣。所有樣本的曲線趨于平緩，說明測序數量充足，即能夠反映樣本絕大部分的菌群信息。稀釋曲線和Shannon-Wiener曲線均表明試驗中各貝肉樣品測序數據合理，獲得的測序結果真實有效。

圖1 Rank-Abundance曲線圖Figure 1 Rank-Abundance Graph

圖2 稀釋曲線Figure 2 Rarefaction curve

圖3 Shannon-Wiener曲線Figure 3 Shannon-Wiener curve

2.4 Alpha多樣性

由表2可知，各樣本的Coverage值都高于0.998，說明檢測序列深度足夠，細菌多樣性分析結果科學可信[21]。新鮮和凍藏1周樣品的Ace、Chao1和Shannon指數均高于凍藏3周和9周的樣品，說明新鮮和凍藏1周紫貽貝肉的群落豐富度高于凍藏3周和9周紫貽貝肉。這是由于隨著凍藏時間的延長，一些對溫度耐受性低的菌種(如嗜溫菌)失去生理活性，致使貝肉中優勢菌菌群結構發生了顯著性變化，翁佩芳等[22]的研究也表明凍藏環境可抑制鮐魚鰓體系中細菌的生長，與試驗結果相似。此外，凍藏1周樣品的豐富度和多樣性均略高于新鮮樣品，可能是因為短時間的凍藏只減緩了細菌的生長繁殖速度，并未完全抑制細菌生長活動。相較于凍藏3周，最后一組紫貽貝肉樣品的Ace、Chao和Shannon指數值均增大，而且Simpson指數值減小，說明其菌群的豐度和多樣性均升高。多半是因為此時貝肉已被很多腐敗菌污染，同時其表面殘留的部分嗜冷微生物，由亞致死狀態逐漸恢復活力，從而導致紫貽貝肉表面菌群多樣性升高。

2.5 微生物組成

在某一分類學水平上，群落柱形圖能反映各樣本中微生物的種類和序列數，即各微生物的相對豐度。在屬水平上，各樣本的優勢菌群中均包含弧菌屬(Vibrio)，隨著凍藏時間的延長，葡萄球菌屬(Staphylococcus)的占比逐漸降低。凍藏1周時優勢菌群增加了嗜冷菌屬(Psychrobacter)。凍藏3周新增芽胞桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)，凍藏9周時新增希瓦菌屬(Shewanella)且相對豐度很大，另外僅新鮮紫貽貝和凍藏9周樣本的優勢菌群中含有不動桿菌屬(Acinetobacter)。

新鮮紫貽貝肉中不動桿菌為優勢菌群，伴隨長時間的低溫脅迫，不動桿菌屬的相對豐度逐漸降低，是由于其耐低溫能力較弱導致的。由于各種腐敗菌的生存能力是不同的，凍藏9周紫貽貝肉中不動桿菌亦為優勢菌群，葉萍萍[23]在微凍鳙魚保鮮研究中發現，微凍后期鳙魚的優勢菌中也含有不動桿菌屬，與試驗中凍藏9周的結果相似。與前兩組相比，后兩組的微生物組成存在顯著的不同，菌群多樣性減小，豐度升高。由于長時間的凍藏，葡萄球菌屬的占比逐漸減小，尤其在第9周時葡萄球菌的占比減小至零。長時間的低溫脅迫使葡萄球菌從鮮活到亞致死狀態直至死亡。希瓦氏菌屬也是水產品的腐敗菌之一，耐低溫[24]，凍藏9周時其豐度占比非常高，表示此時紫貽貝肉已被很多腐敗菌污染，會對其品質產生很大影響。雖然凍藏環境可以降低貝肉中菌群的多樣性，但是依然會存在以上幾種常見的嗜冷菌，所以對凍藏貝類產品，需要對這些腐敗菌進行重點調控。另外，Illumina MiSeq測序目前無法鑒定到種，所以無法確定樣品中是否還存在其他致病性菌株，但也應引起重視。

表2 多樣性指數表Table 2 Diversity index

2.6 菌群組成(門水平)

Heatmap圖是用定義的色彩深淺及相似水平來反映各樣品在某一分類水平上微生物組成的相似程度和差異程度[25]。對各樣本進行OTU聚類，繪制出各試驗組的微生物豐度聚類熱圖，如圖5所示。總的來說，由于長時間的低溫脅迫，在凍藏后期紫貽貝肉樣品中的微生物組成動態變化劇烈，菌群種類不斷減少。由于凍藏時間較短，新鮮的和凍藏1周的紫貽貝肉菌群結構相似。分析豐度聚類熱圖可知，在門水平上，各試驗組中變形菌門(Proteobacteria)均是占比最大的微生物。伴隨長時間的低溫脅迫，擬桿菌門(Bacteroidetes)、硬壁菌門(Firmicutes)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)和硝化菌(Nitrospinae)等微生物的占比均逐漸減小。可能是這些菌種生長繁殖需要較高水分活度，而凍藏后貝肉水分活度降低導致其占比降低。這與高乾坤等[26]關于冷藏帶魚的研究中菌群變化情況相同。對比各試驗組，腐敗菌、致病菌的相對豐度、菌群結構和組成菌發生了劇烈變化。

圖4 不同凍藏時間貝肉微生物物種組成(屬水平)Figure 4 Bacterial community composition at genus level in different frozen times mussel meat

圖5 不同凍藏時間樣品微生物豐度聚類熱圖(門水平)Figure 5 Microbial community heatmap analysis at door level in different frozen times samples

所以，控制好紫貽貝肉的凍藏時間，對避免紫貽貝肉腐敗至關重要。

2.7 β多樣性

在主成分分析圖中不同樣本之間愈近，表示其菌群組成和結構愈類似。如圖6所示，新鮮紫貽貝肉和凍藏1周的紫貽貝肉樣本距離較近，而凍藏3周和凍藏9周的紫貽貝肉樣本均相距較遠，說明新鮮紫貽貝肉和凍藏1周的紫貽貝肉的菌群組成和結構相似，而在凍藏過程中各樣本的微生物結構動態變化劇烈。這與豐度聚類熱圖的分析結果相同。

圖6 不同凍藏時間樣品主成分分析Figure 6 Principal component analysis of different frozen times samples

3 結論

采用高通量測序技術得到不同凍藏時間的紫貽貝肉中微生物基因序列，聚類分析了其微生物組成及結構變化情況。結果表明，各樣品中OTU最少的是凍藏9周樣本，最多的是新鮮紫貽貝肉。多樣性指數分析得知，菌群豐富度和多樣性最低的是凍藏3周紫貽貝肉。這可能是由于凍藏時間的延長，多數微生物在長期低溫脅迫環境下，生命活動減弱直至死亡，僅有部分嗜冷菌存活。凍藏后期多樣性、豐富度降低后又升高，說明凍藏9周時已污染較多腐敗微生物。主成分分析得知，前2組的紫貽貝肉中的菌群組成和結構相似。聚類分析發現，在門水平上，各試驗組中變形菌門均是占比最大的微生物，由于長時間的低溫脅迫，擬桿菌門、硬壁菌門等占比均減少，多半是這些菌種生長繁殖需要高水分活度。在屬水平上，各樣本的優勢菌群中均包含弧菌屬，其可能是導致貝肉腐敗的微生物之一。隨著凍藏時間的延長，葡萄球菌屬的占比逐漸降低。凍藏9周時希瓦菌屬的相對豐度很大。低溫貯藏環境雖可減少貝肉中微生物種類，但仍存在以上幾種典型的嗜冷菌，而且希瓦氏菌屬、不動桿菌屬和弧菌屬均是腐敗菌和致病菌。在凍藏紫貽貝肉時，保證其品質和質量安全需要針對以上幾種腐敗菌重點調控。