癲癇清顆粒對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響和作用機(jī)制研究

齊越 李熒 賈冬 楊彩瑜 房曉楠 李紀(jì)彤

[摘要] 目的 觀察癲癇清顆粒對AD小鼠模型BBB的影響。 方法 采用側(cè)腦室注射Aβ復(fù)制AD模型。選取80只小鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，癲癇清顆粒12.48 g/kg組、6.24 g/kg組、3.12 g/kg組，鹽酸多奈哌齊組，BD1047（sigma-1受體抑制劑）1 mg/kg組，BD1047+癲癇清顆粒12.48 g/kg組，每組各10只。假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物;同時(shí)BD1047組和BD1047+癲癇清12.48 g/kg組，則按照1 mg/kg的劑量腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥21 d。末次給藥后，Morris水迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;HE法觀察腦組織病理學(xué)變化;硫黃素S染色檢測腦組織中Aβ表達(dá)水平;Western blotting法測定海馬和皮質(zhì)中Occludin、ZO-1、Cx43、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與模型組比較，BD1047+癲癇清顆粒12.48 g/kg組、癲癇清顆粒12.48 g/kg組、6.24 g/kg組及3.12 g/kg組及鹽酸多奈哌齊組小鼠穿臺(tái)次數(shù)、p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著增加，Aβ表達(dá)水平降低，occludin、ZO-1及Cx43表達(dá)水平均顯著升高，其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;各給藥組小鼠腦組織病理變化均得到不同程度改善。 結(jié)論 癲癇清顆粒可激活sigma-1受體，通過PI3K/AKT信號(hào)途徑，抑制Aβ表達(dá)，保護(hù)BBB完整性，改善AD學(xué)習(xí)記憶障礙。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病;血腦屏障;Sigma-1受體;小鼠;連接蛋白

[中圖分類號(hào)] R969.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）32-0034-06

[Abstract] Objective To observe the effect of Dianxianqing particles on brain blood barrier（BBB） model of mice with Alzheimer′s disease（AD）. Methods The AD model was replicated by lateral ventricular injection of amyloid β-protein （Aβ）. A total of 80 mice were randomly divided into the sham-operated group， the model group， the Dianxianqing particles 12.48 g/kg group， the Dianxianqing particles 6.24 g/kg group， the Dianxianqing particles 3.12 g/kg group， the donepezil hydrochloride group， the BD1047（sigma-1 receptor inhibitor） 1 mg/kg group and the BD1047+Dianxianqing particles 12.48 g/kg group according to their body weight， with 10 mice in each group. The mice in the sham-operated group and the model group were given distilled water and the corresponding drugs were gavaged in each administration group. Meanwhile， the BD1047 group and the BD1047+Dianxianqing particles 12.48 g/kg group were administered intraperitoneally at a dose of 1 mg/kg once daily for 21 days. After the final administration， the learning and memory ability of mice was detected by Morris water maze test. The pathological changes of brain tissues were observed by hematoxylin-eosin staining（HE） method. The expression level of Aβ in brain tissue was detected by thioflavin S staining. The expression levels of occludin， zonula occludens-1（ZO-1）， connexin 43 （Cx43）， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）， p-PI3K， serine-threonine kinase （AKT） and p-AKT in hippocampus and cortex were determined by Western blotting. Results Compared with the model group， the number of platform crossings and the expression levels of p-PI3K and p-AKT significantly increased in the BD1047+Dianxianqing particles 12.48 g/kg group， the Dianxianqing particles 12.48 g/kg group， the Dianxianqing particles 6.24 g/kg group， the Dianxianqing particles 3.12 g/kg group and the donepezil hydrochloride group. Meanwhile， the expression level of Aβ decreased， and the expression levels of occludin， ZO-1 and Cx43 significantly increased. There were no statistically significant differences in the remaining indicators. The pathological changes in the brain tissues of mice were improved to different degrees in each administration group. Conclusion Dianxianqing particles can activate sigma-1 receptor， as well as inhibit Aβ expression and protect BBB integrity through PI3K/AKT signaling pathway， thus improving learning and memory impairment of mice with AD.

[Key words] Alzheimer′s disease; Blood brain barrier; Sigma-1 receptor; Mice; Connexin

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）為一種老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力減退、認(rèn)知功能障礙，并伴有神經(jīng)精神異常和行為障礙。AD病因復(fù)雜，細(xì)胞外淀粉樣蛋白（Amyloid，Aβ）沉積被認(rèn)為是AD的主要病理學(xué)特征[1]，并與血腦屏障（Blood-brain barrier，BBB）破壞密切相關(guān)[2]。動(dòng)物和臨床研究表明，BBB功能障礙是AD的病理結(jié)果，并會(huì)加速其疾病進(jìn)展[3-4]。因此，阻止Aβ誘導(dǎo)的BBB破壞對于AD治療較為重要。

Sigma-1受體是一種伴侶蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)[5]。由于其功能復(fù)雜，故參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，如AD、亨廷頓病、抑郁癥等[6]。最近的研究表明，Sigma-1受體表達(dá)的改變對BBB內(nèi)皮細(xì)胞的活力和遷移具有深遠(yuǎn)的影響[7-8]。癲癇清顆粒為專利藥（專利號(hào)：ZL 2011 1 0069494），由郁金、菖蒲、柴胡、水蛭等多味中藥組成，具有豁痰息風(fēng)、活血通絡(luò)、開竅益智的功效。前期研究表明，癲癇清顆粒可通過抑制Aβ沉積和tau蛋白磷酸化，改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[9]，但是否具有保護(hù)BBB完整性的作用則尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用側(cè)腦室注射Aβ誘導(dǎo)AD模型以此考察癲癇清顆粒是否通過sigma-1抑制Aβ沉積調(diào)節(jié)BBB完整性，并探討其相關(guān)機(jī)制，為癲癇清顆粒的臨床應(yīng)用提供夯實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 儀器? 腦立體定位儀（成都泰盟科技公司，型號(hào)：DW-200）;微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠，規(guī)格：10 μL）;Y迷宮（遼寧中醫(yī)康復(fù)中心）;Morris水迷宮（成都泰盟科技公司，型號(hào)：MT-200）。

1.1.2 藥物與試劑? 癲癇清顆粒（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，批號(hào)20140110，規(guī)格：生藥含量為5.31 g生藥/g）;鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號(hào)140 606 A，規(guī)格：5 mg] ;BD1047（TOCRIS公司，貨號(hào)：138356-21-5）;淀粉樣蛋白（Aβ25-35，美國Sigma公司，貨號(hào);A4559）;兔抗磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）多克隆抗體（批號(hào)：GR3245955-1）均購自美國Abcam公司，兔抗磷酸化PI3K（Phospho-phosphatidylinositol 3 kinase，p-PI3K）多克隆抗體（批號(hào)：bs-6417R），兔抗絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Protein kinase B，AKT）多克隆抗體（bs-10724R），兔抗磷酸化AKT（Phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗體（批號(hào)：bs-0876R），兔抗肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（bs-10966R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗緊密連接蛋白（occludin）多克隆抗體（批號(hào)：L02141996）、兔抗胞質(zhì)附著蛋白-1（tight junction protein 1， ZO-1）多克隆抗體（批號(hào)：H09253419）、兔抗連接蛋白43（Connexin-43，Cx43）多克隆抗體（批號(hào)：I06142837）均購自沈陽萬類生物科技有限公司，硫磺素-S（美國Sigma公司，批號(hào);MKCC1990），二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120219200821）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.1.3 動(dòng)物? SPF級健康ICR雄性小鼠80只，體重20～24 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXY（遼）2015-0001。所有受試動(dòng)物均飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)室溫度為20～23℃、相對濕度為50%～60%。本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制備? 參考文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)[10]。小鼠給予350 mg/kg的水合氯醛麻醉后，固定予腦立體定位儀上，剪毛，常規(guī)碘伏酒精消毒，手術(shù)刀縱向切開頭部皮膚長約2 cm，以囟門為原點(diǎn)，向右移動(dòng)1 mm，后移動(dòng)0.5 mm，作為側(cè)腦室的體表投射點(diǎn)，微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針，深度為3 mm，緩慢注射3 μL老化的Aβ25-35（1 mg Aβ25-35溶解到940 μL生理鹽水中，37℃孵育120 h），彌散5 min。傷口消毒后，縫合，置于鼠籠中飼養(yǎng)，注意術(shù)后保暖。假手術(shù)組注射等體積無菌生理鹽水。在實(shí)驗(yàn)造模及給藥過程中對大鼠進(jìn)行一般狀況觀察，并對死亡情況進(jìn)行記錄。

1.2.2 分組及給藥? 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=10）和模型組（n=70）。模型組小鼠按“2.1”項(xiàng)下操作復(fù)制AD模型;假手術(shù)組小鼠麻醉后側(cè)腦室注射無菌生理鹽水，其余步驟同造模組（腹腔注射的均為生理鹽水）。造模過程中，無小鼠死亡，參考文獻(xiàn)的造模成功標(biāo)準(zhǔn)[10]，70只小鼠全部造模成功。將70只小鼠按體重隨機(jī)分為模型組、癲癇清顆粒高、中、低劑量組（12.48、6.24、3.12 g/kg，以生藥量計(jì)）、鹽酸多奈哌齊組（灌胃給藥1.3 g/kg）、sigma-1R抑制劑（BD1047，腹腔注射1 mg/kg）和癲癇清顆粒組（12.48 g/kg，以生藥量計(jì)）+BD1047組（腹腔注射1 mg/kg）。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，藥物用蒸餾水進(jìn)行溶解稀釋，假手術(shù)組與模型組小鼠均給予灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水;每日給藥1次，連續(xù)21 d，給藥體積為20 mL/kg。癲癇清顆粒組：按癲癇清顆粒臨床人用量每日24 g計(jì)，小鼠用量為24 g×0.0026（20 g小鼠與70 kg人的系數(shù)比）×50=3.12 g/kg（以生藥量計(jì)），為臨床等效量作為低劑量;2倍量（6.24 g/kg，以生藥量計(jì)），作為中劑量;4倍量（12.48 g/kg，以生藥量計(jì)）作為高劑量;鹽酸多奈哌齊組：按鹽酸多奈哌齊人用量10 mg計(jì)，小鼠用量為10 mg×0.0026（20 g小鼠與70 kg人的系數(shù)比）×50=1.3 mg/kg;BD1047組：小鼠用量為參考文獻(xiàn)用量[11]。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)? Morris水迷宮為直徑80 cm、高33 cm的白色圓桶狀裝置。將水迷宮裝置分為四個(gè)等面積的扇形區(qū)域，分別記為第一至第四象限。平臺(tái)為俯視圓形，側(cè)視工形的白色金屬裝置。平臺(tái)位于第一象限扇形區(qū)域中間位置。桶內(nèi)裝水，水中混勻可食用白色素掩蓋平臺(tái)位置，保持水面高于平臺(tái)1 cm。第16天至第20天，為小鼠訓(xùn)練時(shí)間，每天游泳兩次，間隔4 h。第21天為空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.2 腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察? 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色。小鼠快速取腦后，將其固定于4%多聚甲醛中，浸泡24 h。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水后制備切片（切片厚度為4 μm），進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 腦組織內(nèi)Aβ表達(dá)的測定? 4 μm厚的石蠟切片來源于“2.4”項(xiàng)下的小鼠腦組織切片。石蠟切片脫蠟至水，自來水沖洗;磷酸鹽（PBS）緩沖液沖洗2 次，每次5 min;切片置于3%過氧化氫中10 min以滅活內(nèi)原性酶;PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min;1%硫黃素-S乙醇溶液避光孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min，JEOA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組陽性細(xì)胞平均光密度值。

1.3.4 腦組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、occludin、ZO-1及Cx43的測定? 每組隨機(jī)選取4只小鼠，在小鼠的腦組織中加入高效的裂解液后，勻漿，12 000 r/min（4°C）離心20 min，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。總蛋白為40 μg進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再以恒流電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上（100 mA、2 h）。用5%的脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉2 h后，加入PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶400）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶300）、Occludin（1∶300）、ZO-1（1∶200）、Cx43（1∶300）和β-actin（1∶1000）一抗，4°C孵育過夜，PBS洗膜，每次10 min，連續(xù)3次;加入二抗（1∶5000），室溫內(nèi)孵育2 h，PBS洗膜，每次10 min，連續(xù)3次。加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光，采用Image J V1.8.0.112圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，若方差不齊性則采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果

造模后，假手術(shù)組小鼠飲食進(jìn)水及活動(dòng)度良好，精神狀態(tài)正常;模型組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、倦怠懶動(dòng)、目光遲滯等情況。灌胃給藥后，各給藥組小鼠的精神狀況及活動(dòng)度有所增加，而模型組小鼠一般情況無明顯變化。

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組、鹽酸多奈哌齊組和BD1047+癲癇清12.48 g/kg組穿越平臺(tái)的次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，BD1047組穿越平臺(tái)次數(shù)無明顯差異（P>0.05）。見表1。

2.3 腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

假手術(shù)組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列有序，細(xì)胞核清晰，核仁明顯，胞漿著色均勻，未見壞死和炎癥細(xì)胞浸潤;模型組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞間隙増寬，胞體形狀不規(guī)則，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，核固縮明顯，可見不同程度的神經(jīng)元變性壞死;癲癇清顆粒高、中、低劑量組可見小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)呈現(xiàn)輕、中、重的變化;鹽酸多奈哌齊組可見小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，錐體細(xì)胞排列緊密;BD1047組可見小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，胞核固縮、溶解、消失;BD1047+癲癇清12.48 g/kg組可見小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元與周圍組織的間隙減小，散在的神經(jīng)元減少，錐體細(xì)胞排列緊密，可見少量核固縮。見封三圖2。

2.4 各組小鼠Aβ表達(dá)結(jié)果

為了明確癲癇清顆粒對AD模型小鼠腦內(nèi)病理特征的影響，本實(shí)驗(yàn)采用硫黃素S染色檢測Aβ在AD模型小鼠腦組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在假手術(shù)組中未觀察到陽性染色的Aβ斑塊。與假手術(shù)組相比，模型組和BD1047組小鼠陽性染色的Aβ斑塊數(shù)量和面積均明顯增加（P<0.01）。與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組、癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組及BD1047+癲癇清12.48g/kg組小鼠腦組織內(nèi)Aβ斑塊的陽性染色明顯減少（P<0.05，P<0.01）。見封三圖3、表2。

2.5 各組小鼠BBB中連接蛋白表達(dá)的結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用Western bolt法檢測皮質(zhì)和海馬部位連接蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Occludin、Cx43及ZO-1的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組和鹽酸多奈哌齊組Occludin、Cx43及ZO-1的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，BD1047組Occludin、Cx43及ZO-1的表達(dá)無顯著性差異（P>0.05）。與模型組相比，BD1047+癲癇清12.48 g/kg組皮質(zhì)部位Occludin、Cx43及ZO-1的表達(dá)顯著增加，但相比癲癇清顆粒12.48 g/kg劑量組略有減少。見圖1、表3。

2.6 各組小鼠腦組織中PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組皮質(zhì)和海馬部位的p-PI3K、p-AKT表達(dá)顯著降低（P<0.05），PI3K及AKT蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與模型組相比，癲癇清顆粒6.24、12.48 g/kg劑量組和鹽酸多奈哌齊組皮質(zhì)和海馬部位的p-PI3K、p-AKT表達(dá)明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，癲癇清顆粒3.12 g/kg劑量組、BD1047組和BD1047+癲癇清12.48 g/kg組p-PI3K和p-Akt的表達(dá)無顯著性差異，但BD1047+癲癇清12.48 g/kg組PI3K和p-AKT的水平略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2、表4。

3 討論

AD雖然歷經(jīng)了上百年的研究，但發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前為止，較為公認(rèn)的“β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”認(rèn)定Aβ為導(dǎo)致AD復(fù)雜病理事件的始動(dòng)因素，是AD發(fā)生發(fā)展的核心，且與BBB完整性密切相關(guān)。在生理情況下，完整的BBB功能可以促進(jìn)Aβ清除，阻止外周Aβ向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移，避免Aβ的毒性聚集。但當(dāng)BBB的滲透性升高時(shí)則會(huì)造成Aβ的清除減少、Aβ積累和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的增加。更為重要的是，增加的Aβ神經(jīng)毒性又進(jìn)一步破壞BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、分子調(diào)控以及免疫應(yīng)答等，形成惡性循環(huán)，加劇BBB損害。因此，抑制Aβ沉積導(dǎo)致的BBB破壞，對于早期發(fā)現(xiàn)潛在的AD人群及對AD致病機(jī)制的深入研究均有重大意義。

BBB是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足、周細(xì)胞和基底膜共同構(gòu)成的選擇透過性細(xì)胞屏障系統(tǒng)，主要包括閉合蛋白、連接蛋白（Cx43，ZO-1，occludin）等[12]。AD患者Cx43、ZO-1、Occludin表達(dá)減少，BBB通透性增加[13]，學(xué)習(xí)記憶能力下降;APP/PS1小鼠腦中ZO-1表達(dá)顯著降低，BBB發(fā)生損傷[14];Occludin敲除基因小鼠可表現(xiàn)出嚴(yán)重的BBB滲漏[15]。以上研究均說明，連接蛋白的表達(dá)與BBB功能有關(guān)，并影響學(xué)習(xí)記憶能力。Aβ主要在與認(rèn)知活動(dòng)密切相關(guān)的腦區(qū)富集，如大腦皮層和海馬等，且與BBB密切相關(guān)[16]，Aβ沉積增加，則BBB通透性增強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)參考Aβ斑塊密度最大的兩個(gè)區(qū)域，即皮質(zhì)、海馬部位，檢測BBB緊密連接蛋白的表達(dá)。鹽酸多奈哌齊具有改善AD模型小鼠行為學(xué)的作用，且可抑制Aβ沉積，廣泛應(yīng)用于AD的治療[17]。故本研究選用鹽酸多奈哌齊作為陽性對照藥。Sigma-1R是一類區(qū)別于G蛋白偶聯(lián)和離子型受體的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和相關(guān)的免疫和內(nèi)分泌組織中。本文的前期研究表明，sigma-1受體活化后可抑制Aβ沉積，降低BBB通透性，改善學(xué)習(xí)記憶障礙（數(shù)據(jù)未見報(bào)道），說明sigma-1受體與BBB密切相關(guān)。本研究在AD小鼠模型的基礎(chǔ)上給予sigma-1受體抑制劑BD1047發(fā)現(xiàn)，根據(jù)表3數(shù)據(jù)表示，與模型組相比，BD1047組皮質(zhì)、海馬部位Cx43、ZO-1、Occludin表達(dá)、Aβ沉積無明顯差異，而BD1047與癲癇清顆粒聯(lián)用后，與模型組相比，小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增加，皮質(zhì)、海馬部位Cx43、ZO-1、Occludin表達(dá)提高，Aβ沉積減少，說明癲癇清顆粒通過激活sigma-1受體抑制Aβ沉積，降低BBB通透性，改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110所組成的異二聚體。AKT也叫蛋白激酶B，是PI3K的下游效應(yīng)分子。PI3K磷酸化使質(zhì)膜上生成第二信使，進(jìn)而激活A(yù)KT蛋白中的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。PI3K/Akt作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、衰老、凋亡等過程[18]。研究表明，激活PI3K/Akt信號(hào)通路后，可增加Occludin水平，降低BBB通透性[19]。在本研究中，根據(jù)表4結(jié)果顯示，與模型組相比，BD1047組小鼠的p-PI3K及p-AKT表達(dá)水平無明顯差異，BD1047與癲癇清顆粒聯(lián)用后，與模型組相比，p-PI3K及p-AKT表達(dá)增加，PI3K及AKT表達(dá)未見明顯變化。

綜上所述，癲癇清顆粒具有改善AD模型小鼠BBB損傷的作用，其機(jī)制可能與激活sigma-1受體、通過PI3K/Akt通路抑制Aβ沉積有關(guān)。

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（收稿日期：2021-05-07）