仙藕乳蒲方對糖尿病大鼠皮膚潰瘍創面愈合及線粒體的影響*

陳麗 ，王霄霜 ，周忠志 ，趙思如 ，胡晉婷 ，譚瀅 ，高蘭天 ，王婷婷

（1．湖南中醫藥大學，長沙 410208；2．汕頭大學醫學院第一附屬醫院，汕頭 515041；3．湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007）

糖尿病潰瘍（DU）發病率高，具有難愈、易感染等特點，其難愈主要與線粒體功能缺陷有關[1-2]。研究表明，高糖環境下線粒體結構破壞致產生的三磷酸腺苷（ATP）不能滿足機體能量需求、產生過多的活性氧分子（ROS）可能為糖尿病并發癥發生的共同機制[3-4]。因此，關注糖尿病潰瘍中線粒體結構和功能障礙，為改善潰瘍愈合中能量代謝缺陷、降低氧化應激狀態從而促進愈合有重大意義。前期研究表明[5]，仙藕乳蒲方可加快小鼠創面愈合，蛋白質組學分析表明其作用的關鍵蛋白定位在線粒體中。因此，本課題組通過制作糖尿病大鼠潰瘍模型，電鏡下觀察兩組潰瘍組織中線粒體結構，檢測創面組織ATP、ROS含量，探究仙藕乳蒲方對糖尿病潰瘍中線粒體功能的具體影響，為臨床糖尿病潰瘍治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買雄性SD大鼠48只（SPF級，體質量180～220 g，許可證號：SYXK湘2016-0002）。實驗期間動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗室（許可證號：SYXK湘2015-0003），溫度維持在20～22℃。實驗操作遵循實驗室動物倫理準則和使用指南。

1.2 實驗藥品與試劑 仙藕乳蒲方即仙鶴草、藕節、乳香、蒲黃粉制劑，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室參考課題組已發表論文制備[6]。0．1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號Cat#C1013，100 mL）。鏈脲佐菌素（STZ，上海翊圣生物科技有限公司，批號：60256ES60，100 mg），6-正丙基-2-硫代尿嘧啶（上海源葉生物科技有限公司，批號：530643，25 g），豬膽酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號：S30219，100 g），食用豬油（GB/T8937，生產許可QS430102030013），吐溫-80（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20130128，500 mL），1、2-丙二醇（湖南省天虹試劑有限公司，批號：20160412，500 mL），Rat ROS 酶聯免疫吸附測定（ELISA）Kit（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：RA20694），Rat ATP ELISA Kit（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：RA20768），酶標儀（Labsystems Multiskan MS，型號：352型），洗板機（Thermo Labsystems，型號：AC-8），離心機（國產微量高速離心機，型號：TG16W，培養箱（國產隔水式恒溫培養箱，型號GNP-9080），HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司，批號2114-05）。

1.3 高脂乳劑的配制 取50 g膽固醇分次加入研缽中，研磨至無亮光后將其加入已融化的100 g豬油。加入同時注意攪拌，待充分混勻后依次加入1 g丙硫氧嘧啶、10 g膽酸鈉、100 mL已預熱的吐溫-80和100 mL已預熱的丙二醇，最后緩慢加入蒸餾水定容至500 mL。

1.4 STZ溶液的配制 在避光條件下取出冷凍保存的STZ粉末100 mg和冷藏保存的檸檬酸鈉緩沖液，配制濃度為20 mg/mL的STZ溶液，時間控制在半小時內。

1.5 分組及糖尿病大鼠潰瘍模型制備 所有大鼠使用高脂乳劑每日2 mL/只連續灌胃14 d后，按照40 mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液建立大鼠糖尿病模型。3 d后，尾靜脈采血，測定任意血糖水平，連續3 d血糖≥16.7 mmol/L則為糖尿病模型造模成功。將糖尿病大鼠隨機分為模型對照組、仙藕乳蒲方組，按照10%水合氯醛3.5 mL/kg劑量對兩組糖尿病大鼠腹腔注射進行麻醉，在背部剃毛形成1個4 cm×4 cm正方形裸皮區域，用絡合碘與乙醇消毒處理后在大鼠背部用打孔器創設1個直徑為1 cm的圓形全層皮膚缺損區域，即成功建立糖尿病大鼠背部潰瘍模型。仙藕乳蒲方組大鼠創面敷以仙藕乳蒲方粉末，模型對照組創面不予處理。

1.6 標本采集 大鼠于傷后第3天、第7天、第14天處死，冰上取材，從背部切取一個以創面為中心的2 cm×2 cm的深至腹膜的正方形組織塊。將取下的組織塊放入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中清洗3次，分為3份，電鏡樣本放入2.5%的戊二醛溶液固定，并于4℃保存，送電鏡室檢測。ATP及ROS檢測樣本置于2mL凍存管中，-80℃冰箱凍存，行ELISA檢測。

1.7 指標檢測

1.7.1 創面愈合率 于造模對應時間點用標尺標記潰瘍創面并用相機拍下，再通過圖像分析軟件Image pro plus 6.0計算創面面積，創面愈合率A（%）=（原始創面面積-觀察時間點創面面積）/原始創面面積×100%。

1.7.2 電鏡觀察創面潰瘍組織形態 將標本送中南大學湘雅醫院電鏡室，經脫水、浸透、包埋、聚合、切片等步驟制作好切片后，利用透射電鏡觀察大鼠糖尿病潰瘍創面細胞超微結構改變且拍照。

1.7.3 ELISA檢測ATP含量 按照ELISA試劑盒的實驗步驟進行操作，實驗的大致步驟如下：

1）將皮膚組織樣本消化為組織液。

2）標準品的稀釋：準備6支做好標記的小試管，向所有試管中加入標準品稀釋液100 μL，然后取原濃度標準品100 μL加入第1支試管中，輕輕混勻，再依次從上1支試管中取100 μL液體加入下1支試管并混勻，到第5支試管時，取100 μL液體丟棄，第6支試管作為標準0，則最終各管標準品的濃度為 3 200、1 600、800、400、200、0 nmol/L。在酶標包被板上設標準品孔，依次加入上述濃度的標準品50μL。

3）添加樣品：分別設空白對照孔及待測樣品孔，先加40 μL樣品至待測樣品孔，然后再加10 μL生物素化的抗ATP抗體。

4）加酶：向所有待測孔加入酶標試劑50 μL。

5）溫育：用封板膜封板后于37℃下溫育30min。

6）配液：用蒸餾水30倍稀釋濃縮洗滌液后備用。

7）洗滌：小心揭掉封板膜，丟棄液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。

8）顯色：每孔先后加入顯色劑A與B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。

9）終止：每孔加終止液 50 μL，終止反應，此時見藍色轉黃色。

10）測定：在加終止液后15 min以內，以空白孔調零，于450 nm波長處依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.7.4 ELISA檢測ROS含量 按照ELISA試劑盒的實驗步驟進行操作，標準品稀釋后各管濃度分別是：12、6.0、3.0、1.5、0.75、0 U/mL，加樣時加生物素化的抗ROS抗體10 μL，其余同上。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，計量資料兩個樣本間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組潰瘍創面愈合率 與模型對照組相比，創面愈合第7、14天，仙藕乳蒲方組創面愈合加速，且創面愈合率差異具有統計學意義（P＜0．05）。見圖1、表1。

2.2 兩組創面皮膚組織超微結構觀察 創面愈合第3天，模型對照組膠原纖維較少；腫脹線粒體多、部分嵴消失（見圖2A）；內質網少且伴部分擴張、脫顆粒；仙藕乳蒲方組膠原纖維豐富，排列緊密；線粒體輕度腫脹，少數嵴消失（見圖2B）；粗面內質網數量多，顆粒附著明顯。第7天，模型對照組膠原纖維減前稀疏，排列散亂；細胞核內容物松散染色淺；線粒體結構破壞嚴重，腫脹較前加重，伴聚集、擠壓、融合等改變（見圖2C）；未見明顯內質網；仙藕乳蒲方組膠原纖維豐富，排列緊密有序；細胞核內容物致密染色深；線粒體腫脹較前減輕，較多可見清楚嵴結構的線粒體（見圖2D）。第14天，模型對照組膠原纖維較前豐富，腫脹線粒體數量減少，部分可見清楚嵴結構（見圖2E）；仙藕乳蒲方組膠原纖維豐富，線粒體未見明顯腫脹，形態正常、嵴結構清楚的線粒體聚集（見圖2F）。

2.3 兩組創面皮膚組織ATP含量 與模型對照組相比，創面愈合第7、14天時仙藕乳蒲方組ATP含量均高于模型對照組，且差異具有統計學意義（P＜0．05）。見表 2。

圖1 兩組潰瘍創面不同時間點肉眼觀察Fig.1 Visual observation of ulcer wounds in two groups at different time points

表1 兩組大鼠創面愈合率比較（±s）Tab.1 Comparison of wound healing rates of rats between two groups（±s）%

表1 兩組大鼠創面愈合率比較（±s）Tab.1 Comparison of wound healing rates of rats between two groups（±s）%

注：與模型對照組比較，*P＜0．05。

組別 動物數 時間第3天 第7天 第14天模型對照組 6 85．95±6．49仙藕乳蒲方組 6 93．70±3．64*28．40±11．29 33．44±15．99 45．83±11．59 69．38± 9．36*

圖2 兩組創面皮膚組織超微結構（×10 000）Fig.2 Ultrastructure of the wound skin tissue of rats between two groups（×10 000）

表2 兩組創面皮膚組織ATP含量（±s）Tab.2 The ATP content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

表2 兩組創面皮膚組織ATP含量（±s）Tab.2 The ATP content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

注：與模型對照組比較，*P＜0．05。

組別 動物數 時間第3天 第7天 第14天模型對照組 6 634．03±7．44仙藕乳蒲方組 6 1 108．22±26．74*938．19±4．67 965．12±34．42 827．03±8．24 1 123．50±25．63*

2.4 兩組創面皮膚組織ROS含量 與模型對照組相比，創面愈合第7、14天時仙藕乳蒲方組ROS含量均低于模型對照組，且差異具有統計學意義（P＜0．05）。見表 3。

表3 兩組創面皮膚組織ROS含量（±s）Tab.3 The ROS content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

表3 兩組創面皮膚組織ROS含量（±s）Tab.3 The ROS content in the skin tissues between two groups（±s）nmol/L

注：與模型對照組比較，*P＜0．05。

組別 動物數 時間第3天 第7天 第14天模型對照組 6 4．34±0．07仙藕乳蒲方組 6 3．89±0．03*4．23±0．10 4．08±0．07*4．86±0．07 3．98±0．08*

3 討論

近年來，糖尿病潰瘍發病率增高，且因其長期不愈、反復感染、病理機制復雜等臨床特點，目前仍是臨床治療的重點難點[7]。線粒體是有氧代謝的樞紐，通過呼吸鏈遞氫遞電子參與生物氧化。胡永勝等[8]研究發現，糖尿病大鼠創面存在線粒體功能障礙、能量代謝失衡及三大營養物質合成與分解水平下降的特點，導致了創面的修復障礙。且有研究表明，在糖尿病進程中，持續高糖環境作用下可導致細胞線粒體結構損傷，進而使氧化呼吸鏈無法發揮正常功能，這一方面使得ROS產生增加，造成高水平氧化應激狀態，而后者已被證實[9]是導致糖尿病潰瘍難愈的重要機制；另一方面線粒體作為人體能量生成的主要場所，被破壞后無法維持細胞能量代謝，ATP產生減少，使得機體包括創面修復在內的各種生命活動受阻。有實驗證實[10]，紅外光可通過刺激光感受器細胞色素C氧化酶，使大鼠糖尿病創面能量產生增加、物質代謝加快，進而促進細胞和組織修復。由此可見，線粒體正常結構的維持和功能的發揮可被看作糖尿病潰瘍治療過程中的關鍵環節。

目前，隨著對各種疾病發病機制及治療的深入研究，線粒體已經成為許多諸如肝病、心臟病、阿爾茨海默病等疾病治療的靶點，且線粒體在糖尿病潰瘍治療方面的作用逐漸引起重視，但其作為糖尿病潰瘍的治療靶點的相關研究卻相對較少，尤其在中醫藥方面。仙藕乳蒲方由仙鶴草、藕節、乳香和蒲黃四味中藥制成，在急慢性創面愈合中均起到一定療效。前期研究[5]發現，仙藕乳蒲方可加快小鼠創面愈合，且蛋白質組學分析表明差異表達蛋白主要定位在線粒體中，但仙藕乳蒲方對糖尿病潰瘍皮膚組織中線粒體的影響尚不清楚。

本研究通過構建糖尿病大鼠潰瘍模型發現，使用仙藕乳蒲方干預后，在愈合中晚期大鼠潰瘍愈合加速，且在透射電鏡下觀察到此時潰瘍皮膚組織成纖維細胞中線粒體破壞程度更輕，結構完整的線粒體豐富。與此同時，ELISA結果顯示出在愈合中晚期，仙藕乳蒲方組創面組織中ATP含量更高，而ROS含量則更低。這表明在糖尿病潰瘍愈合的第7、14天，仙藕乳蒲方可通過減輕高糖環境下線粒體結構損傷和功能障礙，改善細胞能量代謝，降低氧化應激水平，從而改善組織愈合環境，加快糖尿病潰瘍愈合進程。另外，筆者的研究中發現在潰瘍愈合第3天，仙藕乳蒲方組的ROS水平較模型對照組低，且差異具有統計學意義，這可能與線粒體并不是ROS的唯一來源有關，也證實了在糖尿病高糖環境下線粒體是氧化應激損傷的主要靶位，即持續的氧化應激與線粒體損傷之間互為因果、惡性循環[11-12]，仙藕乳蒲方可能還作用于其他分子通路而降低糖尿病潰瘍創面的氧化應激水平，有待深入探討研究。

綜上，筆者證實仙藕乳蒲方具有通過防護線粒體損傷，促進糖尿病潰瘍愈合的療效，為其臨床應用提供理論依據，此外，這也為研發以線粒體為靶點治療糖尿病潰瘍愈合藥物提供了新的思路。