直接測序法構建圈養大熊貓MHC遺傳檔案

朱英，李裕冬，何鳴，胡蘭，吳虹林*

(1.四川省自然資源科學研究院，成都610015；2.中國大熊貓保護研究中心，四川都江堰611800)

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)是脊椎動物基因組中多態性極高的功能性多基因家族之一，它編碼的蛋白分子能夠識別、結合、呈遞抗原并激發一系列免疫反應(Klein，1986)。MHC基因家族包括呈遞胞內病原菌抗原的Ⅰ類MHC基因和呈遞胞外病原菌抗原的Ⅱ類MHC基因(Piertney &Oliver，2006)。

由于MHC基因編碼的蛋白質分子在脊椎動物的免疫系統中扮演著重要的角色，瀕危物種的MHC基因得到了動物保護工作者的關注，學界陸續開展了諸如大熊貓Ailuropodamelanoleuca(Chenetal.，2010，2013；Zhuetal.，2013a，2013b)、川金絲猴Rhinopithecusroxellana(Luo &Pan，2013；Zhangetal.，2018)、林麝Moschusberezovskii(Lietal.，2014；Yaoetal.，2015)、紅腹錦雞Chrysolophuspictus(Zengetal.，2016a,2016b)、揚子鱷Alligatorsinensis(Zhaietal.，2017；Hanetal.，2019)和朱鹮Nipponianippon(Lanetal.，2019；Sunetal.，2019)等瀕危動物的MHC遺傳多樣性評估、MHC配偶選擇機制的解析、MHC與疾病的關系等研究，推動了MHC基因在瀕危動物保護中的應用。

Zhu等(2019，2020)研究表明，MHC基因與大熊貓的配偶選擇以及抗寄生蟲感染能力有密切的關系，前者研究表明大熊貓的MHC配偶選擇的機制影響了大熊貓的自然交配行為，以及大熊貓的繁殖成功率；雌性大熊貓偏愛特定MHC基因(Aime-C、Aime-I、DQ)是雜合子的雄性以及傾向于選擇與自身MHC(Aime-C、DQ、DR)基因型相異的雄性交配；MHC基因型差異越大的配偶之間交配成功率越高。后者研究表明大熊貓擁有西氏貝蛔蟲Baylisascarisschroederi的MHC抗性基因；與MHC基因純合的大熊貓相比，MHC雜合的大熊貓不易感染西氏貝蛔蟲，且感染程度也遠低于MHC基因純合的個體。這些發現表明MHC基因的遺傳參數可以用于指導大熊貓的繁育計劃、寄生蟲防控、野外放歸個體選擇等種群管理工作。因此，建立圈養種群的MHC遺傳檔案，并獲得遺傳多樣性等相關參數對于大熊貓的遺傳管理具有重要的應用價值。

中國大熊貓保護研究中心擁有目前世界上最大的大熊貓人工圈養種群(截止2019年底，313只，約占人工圈養種群數量的50%以上)，該中心的大熊貓MHC遺傳參數將是我國人工圈養種群的遺傳管理的重要參考指標。大熊貓MHC基因分型主要采取以聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術為基礎的單鏈構象多態性的方法(Chenetal.，2010，2013；Zhuetal.，2013a，2013b)。該方法已成功應用于大熊貓的10個經典的MHC基因的分型工作中，包括4個Ⅰ類MHC(Aime-C、Aime-F、Aime-I、Aime-L;Zhuetal.，2013a)和6個Ⅱ類MHC基因(Aime-DRA、Aime-DQA1、Aime-DQA2、Aime-DQB1、Aime-DQB2和Aime-DRB3;Chenetal.，2013)。但該方法需掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術，且需要較高的時間成本(電泳 8～12 h，銀染1～3 h)和勞動成本(Sunnucksetal.，2000)。故為每一只圈養大熊貓建立全面的MHC遺傳檔案是費時費力的工作。鑒于MHC遺傳檔案的重要性，本研究在已有研究的基礎上，建立一種不需聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術且具備較低實驗成本的分型方法，并對大熊貓的所有多態MHC基因進行分型，構建大熊貓的MHC遺傳檔案，以完善我國人工圈養種群的遺傳管理體系。

1 方法

1.1 樣品采集

本研究于2016年8月共收集91只大熊貓的糞便樣品，分別來自中國大熊貓保護研究中心雅安碧峰峽基地(n=32)、都江堰基地(n=21)、臥龍神樹坪基地(n=38)。為了不干擾大熊貓活動，糞便樣品由中國大熊貓保護研究中心飼養員在08∶30大熊貓進入室外活動場地后在室內采集，糞便的排出時長小于12 h。糞便樣品在4 ℃的條件下2 h內運輸至實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增、基因分型

在大熊貓的10個MHC基因中，Aime-F、Aime-DQB2和Aime-DRA位點在圈養種群中均只有1條等位基因(Chenetal.，2010；Zhuetal.，2013a)，不具有多態性，本研究排除這3個位點，采用其他7個多態的MHC位點(Aime-C、Aime-I、Aime-L、Aime-DQA1、Aime-DQA2、Aime-DQB1和Aime-DRB3)進行遺傳變異分析。糞便DNA提取參考Zhu等(2017)的方法。

現有的單鏈構象多態性分型方法的開發，在一定程度上歸因于高昂的測序費用。隨著測序成本的大幅降低，直接測序法時間成本和勞動成本的優勢便得以凸顯。我們建立了直接測序法進行基因分型的流程(圖1)。對于純合子個體的基因型，可以直接進行PCR產物測序并結合峰圖確認。對于雜合個體的基因型，如果不同基因型的峰圖不同，可以通過堿基組合的特征進行區分。如果不同基因型峰圖一致，需通過克隆分離等位基因進行基因型的確認。所有PCR產物都進行雙向測序，以保證結果的準確性。

利用已發表的基因特異性分型引物(Chenetal.，2013；Zhuetal.，2013b)，對采集的所有熊貓糞便DNA樣品進行PCR擴增、PCR產物純化、直接測序、峰圖分析，進行Ⅰ類MHC基因的exon2-exon3(編碼α1和α2結構域)以及Ⅱ類MHC基因的exon2的分型。

Ⅰ類MHC基因需要進行exon2-exon3單倍型分型。單鏈構象多態性法是分別對exon2和exon3進行分型，再通過譜系驗證確定exon2和exon3的連鎖關系。本研究將exon2的上游引物和exon3的下游引物進行組合后進行PCR擴增、產物直接測序，通過測序峰圖堿基特征直接獲得exon2-exon3的單倍型信息。

1.3 數據分析

所有序列經過手工校對后，利用MEGA X(Kumaretal.，2018)的Clustal W算法進行比對，并計算核苷酸和氨基酸的變異位點數目。大熊貓Ⅰ類MHC基因的抗原結合位點(antigen binding site，ABS)根據人Homosapiens的ABS進行推斷(Zhuetal.，2013a)。使用Genepop 4.0進行等位基因頻率計算和等位基因數目的統計(Rousset，2008)。

2 結果

除DQA1*0104和DQA1*0506外，大熊貓7個多態的MHC基因各自的等位基因兩兩組合，都能夠通過等位基因堿基組合的特征進行區分。對于DQA1*0104或DQA1*0506雜合型，通過PCR擴增、克隆分離等位基因，確定基因型。所有疑似為DQA1*0104或DQA1*0506這2種組合的最終均確認為DQA1*0104雜合型，試驗的大熊貓種群中不含DQA1*0506基因型的個體。

利用直接測序分型方法，從91只大熊貓中分離到45條MHC等位基因(22條 Ⅰ 類MHC等位基因和23條 Ⅱ 類MHC等位基因)。與已報道的 Ⅰ 類和 Ⅱ 類MHC等位基因進行比對，發現了3條新的等位基因，1條來自Aime-I，命名為Aime-I*08；2條來自Aime-L，命名Aime-L*08和Aime-L*09。對于Aime-I位點，新等位基因Aime-I*08與已報道的Aime-I*01～07的差異核苷酸個數為26～35，差異氨基酸個數為13～16，ABS的差異氨基酸個數為9～12。對于Aime-L位點，新等位基因Aime-L*08與已報道的Aime-L*01～07差異核苷酸個數、差異氨基酸個數、ABS的差異氨基酸個數分別為1～26、1～15、1～11；新等位基因Aime-L*09與已報道的Aime-L*01～07的差異核苷酸個數、差異氨基酸個數、ABS的差異氨基酸個數分別為 2～17、1～9、0～7。Aime-L*08與Aime-L*02核苷酸序列相似度為99.8%(1個堿基差異)，氨基酸序列相似度為99.5%(1個氨基酸差異且位于ABS上)。Aime-L*09與Aime-L*03、Aime-L*04均具有2個核苷酸差異(相似度99.6%)和 1個氨基酸差異(相似度為99.5%)。但Aime-L*09與Aime-L*04 具有完全相同的ABS(表1；圖2)。

表1 新分離的等位基因與已報道等位基因的比較Table 1 The comparison of new MHC alleles and known alleles based on nucleotide and amino acid sequences

圈養大熊貓7個多態MHC基因的高頻等位基因(頻率>0.2)為：Aime-C*03、Aime-I*02、Aime-L*02和Aime-L*03、Aime-DQA1*01和Aime-DQA1*03、Aime-DQA2*01、Aime-DQB1*02和Aime-DQB1*04、Aime-DRB3*01和Aime-DRB3*09(表2)。

表2 圈養大熊貓7個多態MHC基因的等位基因頻率Table 2 Allele frequencies for 7 polymorphic MHC loci in the captive giant panda population

3 討論

本研究利用直接測序法成功構建了91只大熊貓的7個多態MHC基因遺傳檔案，并分離得到3條新的Ⅰ類MHC等位基因。現有的大熊貓Ⅰ類MHC基因的單倍型分型采用單鏈構象多態性的方法，該技術雖然能檢測1個堿基的突變，但是當突變的位置靠近引物上下游時，檢測的靈敏度不佳。核苷酸序列比對結果顯示，分離到的Aime-L*08與已報道的Aime-L*02相差1個堿基，且該差異堿基位于exon3的起始位置(靠近引物上游)。而Aime-L*09與Aime-L*04的2個差異堿基分別位于exon3的起始(靠近引物上游)和結束位置(靠近引物下游)。因此，推測Aime-L*08與Aime-L*09的單鏈多態性構象與Aime-L*02、04非常相似，導致這2條等位基因沒有被單鏈構象多態性的方法檢測出來。新等位基因Aime-I*08只在2只個體中被檢測到，低頻可能是導致Aime-I*08在其他種群中沒有被檢測到的原因。

單鏈構象多態性分型方法的良好分型效果僅限于100～300 bp短片段(單堿基變異檢測率達到99%以上)，長度大于400 bp的片段，20%左右的變異不能被檢出(Sunnucksetal.，2000)，不能滿足Ⅰ類MHC基因exon2-exon3的單倍型的準確分型(約600 bp)。本研究采用的PCR產物直接測序法可以直接得到Ⅰ類MHC基因exon2-exon3的單倍型信息，不需要譜系進行輔助推斷，而且不需要進行耗時耗力的電泳和銀染工作。

直接測序法與單鏈構象多態性法相比，時間成本和勞動成本低，不需要掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染的顯色技術，可檢測出引物附近的堿基突變，可直接用于長片段的分型(Ⅰ類MHC基因的單倍型分型)。但是該方法適用于多數等位基因已被分離且序列已知、雜合子序列峰圖易于區分的MHC研究。對于MHC各基因的等位基因已知的物種，如金絲猴(Luo &Pan，2013；Zhangetal.，2018)、林麝(Lietal.，2014；Yaoetal.，2015)、紅腹錦雞(Zengetal.，2016a，2016b)、揚子鱷(Zhaietal.，2017；Hanetal.，2019)和朱鹮(Lanetal.，2019；Sunetal.，2019)，如果具備不同雜合子基因型峰圖堿基易于區分的特點，也可采用直接測序法進行基因分型。隨著測序技術的發展，能夠自動化且進行長片段的精確分型技術，如Pacbio單分子實時測序將為MHC基因研究工作帶來便利。

致謝：感謝峨眉山方好瀕危動物保育有限公司楊海瓊博士、南京林業大學劉宏毅博士提出的寶貴建議。