肝泡型包蟲病特異microRNA的篩選及初步研究

任 賓，樊海寧，王海久，任 利

青海大學附屬醫院 肝膽胰外科，西寧 810001

肝泡型包蟲病(alveolar echinococcosis, AE) 是由多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis, Em) 幼蟲寄生于人體而引起的一種疾病。該病原發于肝臟，呈侵入性、腫瘤樣生長，有“蟲癌”之稱[1]。AE具有潛伏期長、感染初期無明顯癥狀、后期易轉移等特點[2]。

目前棘球蚴病的診斷主要依靠傳統的診斷方法，如臨床診斷、影像學診斷以及免疫學診斷。傳統診斷方法存在一定的不足，且患者間差異較大[3]，而影像學與免疫學在檢測靈敏性與特異性上存在欠缺[4]。分子生物學等技術的發展為棘球蚴病的診斷提供了更多的空間，也使包蟲病患者在早期診斷上有了重大突破。

微小RNA(miRNA)是一類內源性的，長度約為22 nt的小分子非編碼RNA，能夠通過靶向剪切mRNA或者翻譯抑制的方式在基因的轉錄后水平進行調控，進而影響多種生理和病理過程[5-6]。通過深入測序和miRNA微陣列技術，發現宿主細胞或組織中的miRNA在寄生蟲感染過程中被調控，并在宿主對病原體的反應中發揮重要作用[7-8]。Jin等[9]研究發現，感染多房棘球絳蟲會打亂小鼠肝臟中40%與miRNA合成相關的基因，例如ago1、ago4、tarbp2和xrn2等基因，由此通過深度測序分析發現,而在泡球蚴感染寄主的過程中，miRNA也起著至關重要的作用[10]，對其功能性的預測顯示，其中一些miRNA參與了對寄生蟲感染的免疫和炎癥反應[11]。由此可見，加深miRNA對寄生蟲侵染寄主過程中的調控這方面的研究，可針對特異miRNA調控的代謝途徑開發治療性藥物；也可針對病原相關的miRNA進行檢測，提高前期診斷的靈敏性和特異性[12]。循環miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩定存在的分子，可感染蠕蟲的人和動物的血液或體液中穩定地檢測到[7,13-14]。循環miRNA已在各種腫瘤、心臟病、肝損傷等疾病中作為潛在生物標志物，成為早期診斷、分型和預后判斷的重要指標[15-19]。循環miRNA在寄生蟲感染中作為生物標志物也有相關的報道，循環sja-miRNA-223是日本血吸蟲感染的潛在生物標志物[20]。

基于以上推測,肝泡型包蟲可能會導致血漿中miRNA的改變。所以本實驗通過高通量小分子RNA芯片檢測發現,患者病灶區組織和血漿中的miRNA表達譜與正常組織差異明顯，其中一些miRNA具有顯著性差異可作為檢測標志物的候選分子，再通過熒光定量實驗驗證這些潛在的miRNA檢測標志物的候選分子是否存在差異性。探索血漿樣本和組織樣本的miRNA表達異質性，確定血漿循環miRNA作為一種新的生物標志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2016年6月—2018年5月在本院確診的AE患者，選取其中2例患者的病灶邊緣組織、3例患者的臨近病灶邊緣的正常組織、3例患者的血漿樣本進行microRNA芯片檢測，另隨機選取15例患者設為AE組進行驗證。納入同期于本院進行體檢的健康者，選取其中3例健康體檢者的血漿樣本進行microRNA芯片檢測，另隨機選取15例設為健康組進行驗證。AE診斷標準參照《肝兩型包蟲病診斷與治療專家共識(2015版)》[21]。納入標準：(1)血清學包蟲病抗體IgG檢驗、超聲檢查、肝臟三期動態掃描、3.0T MRI動態增強檢查完整者；(2)接受外科手術治療，術后病理亦確診為肝泡球蚴病。排除標準：(1)合并有慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎者；(2)既往有結核病史者；(3)合并其他病史并接受過肝臟手術治療者。

1.2 研究方法

1.2.1 miRNA的提取 手術取下0.5～250 mg組織標本，在15 min內用液氮浸沒迅速降溫保存。使用EDTA抗凝采血管新鮮收集AE患者和健康體檢者的全血標本，4 ℃ 1500 r/min離心10 min收集上層血漿標本。利用 mirVanaTM RNA Isolation Kit(Invitroge，AM1561)提取組織和血漿樣品的總RNA，提取的RNA樣本利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)定量并經Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)檢測RNA完整性。

1.2.2 miRNA芯片檢測組織miRNA表達水平 RNA質檢合格后，參照Agilent Human miRNA Microarray (8*60K，Design ID: 070156)芯片標準流程進行樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫。首先，取100 ng total RNA起始，定容到2 μl，總RNA經過去磷酸化；樣本在37 ℃ PCR儀上變性30 min，再進一步用Cyanine-3-CTP(Cy3)標記。標記好的RNA純化后和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

1.2.3 miRNA數據分析 采用Feature Extraction 軟件 (version10.7.1.1, Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數據。接著利用Genespring軟件(version 12.5; Agilent Technologies)進行quantile標準化和后續處理。對標準化后的數據進行過濾，用于比較的每組樣本中至少有1組75%標記為Detected的探針留下進行后續分析。 利用t檢驗的P值和倍數變化值進行差異miRNA篩選，篩選的標準為:log2(差異倍數)絕對值>1.2、P<0.05。接著，利用3個數據庫(Targetscan、microRNAorg、PITA)共同對差異miRNA進行靶基因預測，對靶基因進行GO和KEGG富集分析，以判定差異miRNA主要影響的生物學功能或者通路。最后，對差異miRNA進行非監督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異miRNA在不同樣本間的表達模式，為后續研究miRNA的篩選做準備。

1.2.4 miRNA表達驗證 利用實時PCR驗證芯片檢測結果，(1)選擇在AE患者肝臟病灶邊緣帶組織差異顯著性表達的hsa-miRNA-4644，hsa-miRNA-136-5p，hsa-miRNA-483-3p。(2)血漿RNA提取與反轉錄：提取200 μl血漿至干凈的1.5 ml離心管中，加入1 ml QIAzol?Lysis Reagent，渦旋混勻，室溫靜置5 min，然后每管加入350 μl miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control (1.6×108拷貝/μl working solution)渦旋混勻，洗滌，從而收集總RNA溶液并進行反轉錄。應用ABI7500定量PCR儀運用SYBR Green實時PCR方法驗證選擇的差異表達miRNA，采用公式: 2-△△ Ct計算基因的相對表達量,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-Actin)，△△Ct=△Ct(實驗樣本)-△Ct (對照樣本)。檢測引物由天根生化科技(北京)有限公司合成，miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Contro(miR39)由QIAGEN公司合成。

1.3 倫理學審查 本研究經新青海大學附屬醫院倫理委員會批準，批號：P-SE-2016056，患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 miRNA表達譜中差異miRNA篩選 2例(1男1女，平均34.5歲)AE患者病灶邊緣組織和3例(1男2女，平均41.5歲)AE患者臨近病灶邊緣正常組織，以及3例(1男2女，平均47.0歲)AE患者血漿樣本和3例(1男2女，平均44.7歲)健康體檢者的血漿樣本共計2549個miRNA中，病灶邊緣組與臨近病灶邊緣正常組比較，以及AE組與健康組比較，存在6個差異miRNA(hsa-miRNA-136-5p、hsa-miRNA-4698、hsa-miRNA-4644、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-1237-3)，其中上調表達有3個miRNA，下調表達有3個miRNA(表1，圖1)。

表1 AE患者miRNA表達譜中的差異miRNA

注：a,血漿樣本;b,組織樣本。灰色點，P>0.05的miRNA;綠色點，log2(差異倍數)絕對值<1.2但P<0.05的miRNA；紅色點，log2(差異倍數)絕對值>1.2且P<0.05顯著性上調的差異miRNA；藍色點，log2(差異倍數)絕對值>1.2且P<0.05顯著性下調的差異miRNA。

2.3 熒光定量驗證與靶基因的預測 驗證樣本AE組15例患者中男8例，女7例，平均46.1歲；健康組15例患者中男6例，女9例，平均44.6歲。血漿樣本驗證發現，hsa-miRNA-483-3p和hsa-miRNA-4644上調表達(P值均<0.05)，hsa-miRNA-136-5p下調表達(P<0.05)(表2)，與表1表達模式一致；血漿樣本驗證發現，hsa-miRNA-483-3p上調表達(P<0.05)(表3)，與表1表達模式一致。驗證結果顯示,hsa-miNAR-483-3p在血漿中的表達情況與組織中的表達情況一致，表明hsa-miR-483-3p可能是AE前期診斷的一個潛在的標志分子。

表2 血漿中差異miRNA水平影響分析

表3 AE組患者組織中差異miRNA水平影響分析

2.4 靶基因的預測與GO分析 分別用TargetScan、PITA、microRNAorg數據庫對差異miRNA進行靶基因預測，對3個數據庫預測到的靶基因取交集，共同擁有137個靶基因(圖2)。在3個靶基因(PITA、Targetscan、microRNAorg)預測的數據庫中，預測到hsa-miRNA-483-3p等調控的靶基因(IL-17A、IL-5、CD40LG、TAP2、TNF、CES1、LBR)，經過查詢相關數據庫和文獻發現，靶基因都是調控參與人體免疫反應及與肝臟疾病有關的基因[22-23]。從圖3 GO分析中可以看出，差異表達的miRNA所調控的基因在生物學過程主要涉及依賴DNA的轉錄調節，其次是參與多細胞生物體的發展調控以及參與T淋巴細胞增值相關的細胞免疫反應等；在分子功能方面主要是與特異性DNA序列結合活性蛋白、泛素結合酶、逆向轉運子、甾類激素等蛋白密切相關； 而在細胞成分方面，則與mRNA切割因子復合物、囊泡膜等多種細胞成分有關。可以根據GO分析的結果結合生物學意義從而挑選關于棘球蚴病相關用于后續研究的基因。

圖2 差異miRNA在不同的數據庫中靶基因預測結果

注：按照P值排序，對前20位的條目(若總條目不大于20，則全部展示)利用條形圖進行展示。

2.5 靶基因的KEGG分析 利用KEGG數據庫對預測得到的靶基因進行Pathway分析，可以找到富集靶基因的Pathway 條目，在差異miRNA靶基因的 KEGG映射中，對在前20位的條目利用條形圖進行展示(圖4)。可以發現這些靶基因主要在Primary immunodeficiency信號通路、IL-17信號通路及TNF信號通路中起重要作用。

3 討論

本實驗采用Agilent Human miRNA Microarray芯片，檢測病灶邊緣帶組織與臨近病灶的正常肝組織及AE患者和健康體檢者血漿中的miRNA，在2549個檢測miRNA中，有6個差異性的miRNA，分別為hsa-miR-136-5p、hsa-miR-4698、hsa-miR-4644、hsa-miR-4306、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-1237-3p。文獻[24]研究表明miRNA與疾病的發生有關，比如hsa-miRNA-1237-3p表達降低與脊索瘤患者生存不良相關。hsa-miRNA-33b-3p在關節炎患者血清中可調節代謝過程，可作為評估關節炎風險及進展的潛在生物標志物[25]。有研究[26]表明，當肝癌細胞在低糖環境中生長時，miRNA-483-3p低表達，使細胞凋亡，而當細胞在高糖環境中生長時，miRNA-483-3p水平升高，降低了凋亡率。這表明，根據葡萄糖的濃度，miRNA-145-5p對miRNA-483-3p有雙重作用，抑制或刺激。這提示可能存在一種在野生型TP53肝癌細胞中抵抗細胞凋亡的新機制，并提示miRNA-145-5p和miRNA-483-3p可能在肝細胞癌中作為藥物靶點[27]。而hsa-miRNA-4306是HPV陰性早期頭頸鱗狀細胞癌患者疾病復發和生存的重要標記[28]。前期研究可以看出本次芯片實驗篩選出來6個差異miRNA與人的多種類型的疾病存在密切的相關性，本研究通過青海區域內人感染AE后的差異miRNA情況，hsa-miRNA-33b-3p、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-4306在AE的病灶邊緣帶這種顯著差異性表達的現象，預示著這些miRNA可能在AE中起到非常重要的作用。

注：按照P值排序，對前20位的條目(若總條目不大于20，則全部展示)利用條形圖進行展示。

循環miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩定存在的分子，循環miRNA涉及到細胞與細胞之間的信息傳遞，主要作用是靶向調控靶基因[29-30]；無細胞循環miRNA通常存在于核糖核蛋白復合物或高密度脂蛋白中，或從脂質體、微泡、外泌體或凋亡體中釋放出來，因此，循環的miRNA可以反映機體的穩態反應以及疾病進展的跡象。由于其穩定性和對內源性RNase活性的抗性，循環miRNA被認為是診斷和判斷治療效果的生物標志物，在癌癥、糖尿病和神經紊亂等領域具有臨床應用的前景[31-33]。目前關于AE相關的循環miRNA的研究還比較少，本研究旨在找到一個與AE相關的miRNA作為診斷標志物，因此在進行了AE組織miRNA的熒光定量驗證后，對于差異的hsa-miRNA-483-3p進行了血漿中的表達檢測，結果顯示,hsa-miRNA-483-3p在血漿與組織中顯著性上調表達，這表明hsa-miRNA-483-3p可能是AE前期診斷的一個潛在的標志分子。

據報道[34-37]，hsa-miRNA-483-3p 在傷口愈合和癌癥進程中受到調節，其也是2型糖尿病患者內皮完整性的重要調節因子，是2型糖尿病患者修復內皮再生的潛在治療靶點[38]。同時也在糖尿病相關的心臟病中起到負調控的作用[39]。綜上研究表明，hsa-miRNA-483-3p是一個病程響應分子，在調控疾病進程中扮演著一定的角色。

有研究[40]發現多房棘球絳蟲感染小鼠之后，高通量測序分析發現差異miRNA的靶基因同一些與宿主的免疫反應有關。同樣地，本研究用TargetScan、PITA、microRNAorg數據庫對差異miRNA進行靶基因預測，3個靶基因預測數據庫中差異miRNA共同擁有137個,hsa-miRNA-1237-3p、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-33b-3p在不同的miRNA靶基因預測數據庫中分別預測到不同數量的靶基因，本實驗發現AE差異性表達的3個miRNA(miR-1237-3p、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-483-3p)的靶基因均與人體免疫反應以及AE有關，例如hsa-miRNA-4306預測與AE相關的靶基因為CD40LG(IMG)、TAP2。CD40LG是腫瘤壞死因子配體家族中的一員，主要表達于已激活的T淋巴細胞上，它與B淋巴細胞上CD40相互作用，促進B淋巴細胞增生和存活、免疫球蛋白類型轉換及生發中心反應。CD40/CD40LG在誘導B淋巴細胞增生分化、產生自身抗體中起關鍵作用。肺泡棘球蚴病患者IgG、IgA和IgM的平均水平及囊性棘球蚴病患者IgG和IgM的平均水平均明顯高于正常對照組,而TAP2基因的多態性在囊性棘球蚴病具有一定的關系[41]。hsa-miRNA-1237-3p的靶基因 IL-17A、IL-5，囊性棘球蚴病感染后通過增強IL-10和下調IL-5、IL-17A，顯著減輕卵白蛋白誘導的氣道炎癥的嚴重程度[42]。hsa-miRNA-483-3p的靶基因為lamin B受體，lamin B受體是一種核膜的多跨膜蛋白，常被用作核膜動力學的“報告者”，有研究[43]表明其表達與原發性膽汁性肝硬化有關。

差異miRNA的靶基因GO分析中可以看出，差異基因在生物學過程涉及到細胞免疫反應(T淋巴細胞的增值)等生物學功能，這可能與多房棘球絳蟲感染后激發患者體內的免疫系統有關；在差異miRNA靶基因的 KEGG分析可以看到，這些靶基因在Primary immunodeficiency信號通路、IL-17信號通路及TNF信號通路中起重要作用，這些與AE相關的信號通路的發現，將會對后期AE的預防治療具有提示的意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻:任賓、任利負責確診病例的收集，RNA的提取和文章的撰寫；樊海寧、王海久負責統計學分析和文章的修改。