食管癌早期發現和高危人群預警液體活檢技術分析

徐瑞華，宋 昕，李恩民，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，趙學科，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，王 偉，李欣然，楊苗苗，楊媛嘖，許麗艷，王立東

(1. 鄭州大學第一附屬醫院河南省食管癌重點開放實驗室、省部共建食管癌防治國家重點實驗室，河南 鄭州 450052；2. 汕頭大學醫學院廣東沿海潮汕地區癌癥高發區分子生物學重點實驗室，廣東 汕頭 515041)

食管癌是上消化道常見的惡性腫瘤，每年新發50萬例食管癌患者中一半以上發生在中國[1-2]，患者的死亡率排在消化系統腫瘤的第2位[3]。食管癌早期無特異性癥狀，確診時大多已達中晚期，5 a生存率僅約20%[4]，嚴重威脅著人們的健康。因此，食管癌的早期發現成了提高患者生存率、降低發病率和死亡率的關鍵。食管癌早期發現主要是指發現無癥狀癌前病變患者和早期浸潤癌患者，并進行針對性個體化干預和治療。食管癌色素內鏡和靶向黏膜活檢組織病理學檢查是實現這一目標的關鍵技術，但是其篩查成本高，并需要由經驗豐富的內鏡醫師操作。因此，這一方法很難在高發區無癥狀人群中進行大規模篩查及推廣應用。目前，已發現的很多食管癌癌變相關分子改變可以不同程度反映在外周血[5]，利用液體活檢技術首先確定高危人群，再進一步行色素內鏡病理活檢，將極大減少內鏡篩查人數，提高針對性篩查效果，節約篩查成本。細胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是食管癌相關抗原[6-7]，本研究正是基于這一思路研發食管癌早期發現液體活檢技術并在高發區推廣應用，為食管癌早期發現和液體活檢技術優化組合提供證據，分析這些分子指標聯合檢測對食管癌早期發現和高危人群預警的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品的收集480例早期食管癌患者和480例健康志愿者的血清樣本來自鄭州大學第一附屬醫院省部共建食管癌防治國家重點實驗室1995年1月至2018年1月建立的樣本庫。480例經組織病理學證實的早期食管癌患者中，男228例、女252例，年齡48～81(58.5±6.4)歲，均未接受放、化療治療。早期食管癌患者納入標準：經組織病理學證實為早期(0期+Ⅰ期)；術前均未進行放、化療等其他治療；血樣在術前收集；未合并其他腫瘤、自身免疫性疾病和炎癥性疾病等影響血清蛋白的疾病。480例健康志愿者中，男228例、女252例，年齡35～82(58.7±9.2)歲。

1.2 方法

1.2.1 血清腫瘤相關抗原自身抗體的檢測 對以上血清標本進行檢測，采用本實驗室已經建立的間接酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測腫瘤相關抗原自身抗體CYFRA21-1、PCNA、TGF-β1[8-9]，包被的3種腫瘤相關抗原自身抗體最終稀釋濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，辣根過氧化物酶標記的抗人IgG稀釋濃度為15 000。在ELISA板孔中加入包被稀釋液稀釋過的腫瘤相關抗原自身抗體100 μL/孔，4 ℃靜置過夜(>24 h)，再加入稀釋后的食管癌患者和健康志愿者血清100 μL/孔，每個樣品至少進行2次檢查，37 ℃孵育。包被已知陽性的血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋的辣過氧化物酶標記的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基聯苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光反應，當陽性對照出現明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL終止反應，并讀取OD450值。血清自身抗體檢測結果判定采用Scripps研究所判定方法確定截斷值，此值以上的為陽性，反之為陰性[5,10]。

1.2.2 高發區無癥狀人群小規模驗證 我們在河南省食管癌高發區林州市用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測試劑盒進行食管癌早期篩查，為532例無癥狀人群進行雙盲血清學檢測和色素內鏡檢查，其中男273例、女259例，年齡35～70(53.3±11.7)歲。

1.2.3 高發區無癥狀人群大規模推廣應用 我們在廣東省和福建省的食管癌高發區醫院采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測試劑盒對當地的無癥狀人群進行早期食管癌篩查，2013年1月至2019年12月，共有10 890例無癥狀人群參與其中，其中男5 389例、女5 501例，年齡35～70(52.5±10.3)歲，對檢測結果為陽性的高危人群進一步行色素內鏡檢查。

1.3 TNM分期及臨床分期標準TNM分期采用國際食管癌TNM分期標準第6版，食管癌臨床分期基于TNM分期，分為早期(0期和Ⅰ期)、中期(Ⅱ期和Ⅲ期)和晚期(Ⅳ期)。

2 結果

2.1 早期食管癌患者和健康志愿者血清3種腫瘤相關抗原自身抗體陽性率比較CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1在早期食管癌中的陽性率分別為27.71%、31.67%、35.83%，均高于健康志愿者(2.92%、2.92%、5.00%)，差異均有統計學意義(χ2=113.752，P<0.001；χ2=138.708，P<0.001；χ2=140.425，P<0.001)。見表1。

表1 早期食管癌患者和健康志愿者血清3種腫瘤相關抗原自身抗體陽性率比較 n(%)

2.2 不同腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測的臨床診斷價值CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測的敏感性67.08%，特異性76.04%，約登指數0.43，最適用于食管癌的早期篩查。見表2、3。

表2 不同腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測在早期食管癌患者和健康志愿者中的陽性率 n(%)

表3 不同腫瘤相關抗原聯合自身抗體檢測用于食管癌診斷的敏感性、特異性、約登指數比較

2.3 高發區無癥狀人群小規模驗證結果我們在河南省食管癌高發區林州市采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測試劑盒對532例高發區無癥狀人群篩查，發現陽性103例(19.36%)，色素內鏡檢查結果示48例不典型增生患者、19例早期食管癌患者、9例中晚期食管癌患者、27例正常食管黏膜者；陰性429例(80.64%)，色素內鏡檢查結果示11例不典型增生患者、2例早期食管癌患者、0例中晚期食管癌患者、416例正常食管黏膜者。高發區無癥狀人群小規模驗證結果證實，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測液體活檢技術的診斷效果與色素內鏡檢查結果相似。見表4。

表4 高發區無癥狀人群CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測和色素內鏡檢查結果比較 n(%)

2.4 高發區無癥狀人群大規模推廣應用結果我們在廣東省和福建省的三家醫院采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測液體活檢技術試劑盒對當地的無癥狀人群進行早期食管癌篩查，結果顯示，參與的10 890例無癥狀人群中，發現高危人群(陽性)1 759例(16.51%)，對陽性人群進一步進行色素內鏡檢查發現812例(12.22%)不典型增生患者、215例(46.16%)早期食管癌患者、23例(1.31%)中晚期食管癌患者、709例(40.31%)正常食管黏膜者。

3 討論

食管癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，5 a生存率僅15%左右，早診、早防和早治是降低食管癌發病率和死亡率的關鍵[11]。隨著醫學相關研究的進步，王立東等[5]發現食管癌變是一個多階段演進的過程，是遺傳-環境-基因交互作用的復雜結果，建立高危人群分子分型和液體活檢技術是實現食管癌早期發現的關鍵環節。

目前，食管癌診斷的金標準依然是胃鏡黏膜病理活檢，胃鏡活檢操作復雜、有創、成本高、接受程度低，不適合在食管癌高發區無癥狀人群大規模推廣應用。我們的研究發現，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1這3種腫瘤相關抗原自身抗體在早期食管癌患者血清中表達遠高于健康志愿者。對上述3種腫瘤相關抗原自身抗體進行聯合檢測發現，早期食管癌的陽性率遠高于單一指標檢測，3種指標聯合檢測敏感性67.08%、特異性76.04%、約登指數0.43。結果提示，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測液體活檢技術可以用于食管癌的早期篩查。

我們用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測試劑盒在河南省食管癌高發區林州市進行小規模無癥狀人群早期食管癌篩查，為532例無癥狀人群進行雙盲聯合血清學檢測和色素內鏡檢查，比較該聯合液體活檢技術與色素內鏡檢查的結果。液體活檢技術發現高危人群(液體活檢陽性)103例，色素內鏡檢查結果示不典型增生、早期食管癌、中晚期食管癌各占48例、19例、9例；液體活檢陰性429例中，色素內鏡檢查結果示不典型增生、早期食管癌、中晚期食管癌分別為11例、2例、0例。結果提示，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測液體活檢技術的效果與色素內鏡檢查相似，適合在食管癌高發區無癥狀人群進行推廣應用。

2013年1月至2019年12月，我們在廣東省和福建省食管癌高發區的三家醫院，采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測液體活檢技術試劑盒對當地的無癥狀人群進行食管癌早期篩查，共有10 890例無癥狀人群參與其中，共發現高危人群(液體活檢陽性)1 759例(16.51%)，對檢測陽性的人群進一步行色素內鏡檢查發現，其中不典型增生812例、早期食管癌215例、中晚期食管癌23例、正常食管黏膜709例，早期發現率較高。10 890例人群通過液體活檢技術篩查后僅16.51%需要進行色素內鏡檢查，也就是說83.49%的人群無需再行色素內鏡檢查，這樣以來不僅大大降低了檢查成本，同時也提高了食管癌早期篩查的依從性和時效性。

綜上所述，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯合檢測液體活檢技術是食管癌早期發現和高危人群預警的有效方法，通過這一方法先鎖定高危人群，再進行色素內鏡檢查，大大減少了內鏡篩查的數量，降低了檢查成本，具有明顯的推廣應用價值。