基于食管癌分子分型液體活檢技術的研發和推廣應用

王盼盼，趙學科，李秀敏，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，孟超龍，胡守佳，程 錕，李留玉，張立國，李志強，劉太江，張高富，陳志國，李喜琴，王立東

(1. 鄭州大學第一附屬醫院河南省食管癌重點開放實驗室、省部共建食管癌防治國家重點實驗室，河南 鄭州450052；2.新鄉醫學院第三附屬醫院消化內科，河南 新鄉 453000；3.新鄉醫學院河南省腫瘤分子治療醫學重點實驗室，河南 新鄉 453003；4.新鄉市中心醫院胸外科，河南 新鄉 453000；5.輝縣市第三人民醫院(孟莊鎮衛生院)腫瘤科，河南 新鄉 453621；6.新鄉同盟醫院腫瘤科，河南 新鄉 453800；7.輝縣市共濟醫院腫瘤科，河南 新鄉 453600)

食管癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率僅次于胃癌，90%以上為食管鱗癌[1]。臨床上首次確診的食管癌患者約90%以上為中晚期，食管鱗癌總體5 a生存率僅15%左右[2]，其主要原因是早期食管癌患者無特異性癥狀，缺乏無創性早期診斷的篩查策略。迄今為止，早期食管癌及癌前病變篩查仍為色素內鏡檢查加病理活檢，其過程痛苦、技術要求高、患者依從性差，難以大范圍推廣。食管癌變是一個多階段演進過程，食管癌前病變形態發展之前已發生多種基因和蛋白的改變，包括來自腫瘤細胞的一組特異蛋白，后者可以導致宿主細胞產生抗原抗體反應，這一組蛋白稱為腫瘤相關抗原[3-4]。因此，檢測外周血腫瘤相關抗原自身抗體可能有助于高危人群篩查和早期發現。過去一些相關研究大多集中在單個腫瘤相關抗原自身抗體檢測或組織中腫瘤相關抗原檢測，導致早期癌檢出率過低。因此，本研究旨在聯合檢測多種腫瘤相關抗原自身抗體，闡明這些標志物對食管癌高危人群預警篩查和早期發現的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料入組研究對象為3組，收集時間為2010年1月至2019年12月。第1組：鄭州大學第一附屬醫院收治的100例早期食管鱗癌患者(食管癌組)及100例正常人(正常對照組)。食管癌組均為經病理確診且未接受任何放化療的初診患者，男54例，女46例，年齡35～69(58.98±7.24)歲；正常對照組來自門診健康體檢人群，并經內鏡病理活檢排除食管癌前病變或早期食管癌，無任何腫瘤相關證據，男51例，女49例，年齡35～70(57.88±7.71)歲。2組研究對象的性別、年齡等基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。第2組(驗證組)：接受流行病學調查和家訪的400例無癥狀人群來自食管癌高發區河南新鄉大塊鎮，男201例，女199例，年齡35～70(53.30±9.71)歲(表1)。第3組(推廣應用組)：獨立于驗證組的食管癌高發區無癥狀人群，入組標準同驗證組，主要來自河南新鄉食管癌高發區的3個自然村，共10 752例，男5 433例，女5 319例，年齡35～70(53.23±9.90)歲(表2)。所有研究對象均排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病等影響血清蛋白質表達的疾病。所有入組研究對象均簽署知情同意書。該研究已被鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

表1 驗證組400例無癥狀人群性別、年齡分布情況

表2 推廣應用組10 752例無癥狀人群性別、年齡分布情況

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 3組人群均取空腹靜脈血5 mL至離心管中，室溫靜置30 min，2 000 r/min離心20 min，取血清并每管100 μL分裝，干冰保存，后轉至-80 ℃冰箱內儲存備用。

1.2.2 血清腫瘤相關抗原自身抗體檢測 所有樣品血清腫瘤相關抗原自身抗體的酶聯免疫吸附試驗均是在不獲取樣品對應臨床信息的前提下進行的。用美國Scripps研究所自行提取和純化的細胞周期蛋白E(CyclinE)、信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)、細胞周期相關轉錄因子1(E2F1)、胰島素樣生長因子2 mRNA-結合蛋白1(IMP1)和P65等共5種抗原對以上血清標本進行腫瘤相關抗原自身抗體水平檢測。采用本實驗室已建立的間接酶聯免疫吸附試驗方法[5-6]，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，辣根過氧化物酶標記的抗人IgG稀釋濃度為15 000。在酶聯免疫吸附試驗板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原100 μL/孔，4 ℃過夜(>24 h)。加入稀釋后的患者血清100 μL/孔，每個樣品至少做2次檢查，37 ℃孵育。已知陽性的血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基聯苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，置于37 ℃避光反應，當陽性對照出現明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL終止反應，并在酶聯免疫吸附試驗讀數儀上讀取450 nm波長處光密度值。

1.2.3 血清腫瘤相關抗原自身抗體檢測結果判定 采用美國Scripps研究所判定方法確定截斷值，讀數在此值以上的為陽性，否則為陰性[7-8]。

1.2.4 色素內鏡檢查和黏膜活檢 對驗證組所有對象、推廣應用組中液體活檢檢測5種腫瘤相關抗原自身抗體有至少1種陽性者進行色素內鏡檢查和黏膜活檢，并常規在食管中1/3段(距門齒28～30 cm)、下1/3段(食管賁門交界線上2～3 cm)各取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機取材，必要時進行食管黏膜碘染色。在食管不染區取材，所有活檢組織均迅速置于體積分數95%乙醇內固定。常規脫水后石蠟包埋，連續切片6張，每張切片厚5 μm，其中1張進行HE染色，核實組織病理學診斷，其余5張行免疫組化檢查。根據細胞形態、組織結構及免疫組化檢查結果，將食管黏膜上皮分為正常、不典型增生和鱗癌。

2 結果

2.1 食管癌組和正常對照組血清5種腫瘤相關抗原自身抗體表達比較食管癌組血清CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65等5種腫瘤相關抗原自身抗體陽性率均高于對照組，差異均有統計學意義(χ2=7.779，P=0.005；χ2=14.222，P<0.001；χ2=13.211，P<0.001；χ2=13.455，P<0.001；χ2=26.510，P<0.001)。5種腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測至少1種陽性用于食管癌診斷的敏感性為77.00%，特異性為87.00%。見表3。

表3 食管癌組和正常對照組血清腫瘤相關抗原自身抗體陽性率比較及對食管癌的診斷效能 n(%)

2.2 驗證組400例無癥狀人群液體活檢和色素內鏡檢查結果比較隨食管癌前病變程度的加重，CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65聯合液體活檢技術至少1種陽性檢出食管病變率呈增加趨勢，而且出現多種腫瘤相關抗原自身抗體陽性現象。在驗證組食管癌高發區400例無癥狀人群中，5種腫瘤相關抗原自身抗體聯合液體活檢技術檢出食管癌8例(72.73%)、癌前病變22例(75.86%)，該方法用于食管癌診斷的敏感性為72.73%，特異性為86.94%。見表4。

表4 驗證組400例無癥狀人群液體活檢和色素內鏡檢查結果比較 n(%)

2.3 推廣應用組10 752例無癥狀人群液體活檢技術聯合色素內鏡檢查結果利用液體活檢技術對推廣應用組食管癌高發區10 752例無癥狀人群進行大規模篩查，篩查出2 043例(19.00%)有至少1種腫瘤相關抗原自身抗體陽性者，定義為高危人群。高危人群進一步進行色素內鏡檢查，發現正常人群1 075例(52.62%)、不典型增生710例(34.75%)、食管癌258例(12.63%)。即在食管癌高發區無癥狀人群中進行液體活檢技術聯合色素內鏡檢查，食管癌檢出率為2.40%(258/10 752)。

3 討論

食管癌早期起病隱匿，缺乏特異性癥狀，其主要篩查手段仍是色素內鏡檢查和黏膜活檢(具有技術要求高、有創、依從性差、效率偏低等劣勢)，加上傳統的高危人群界定標準精準度低(高發區、40歲以上、男性、吸煙、飲酒、家族史陽性)；當對高危人群進行內鏡篩查時，早期癌發現率僅2%左右。這些原因使高發區無癥狀人群大規模篩查食管癌受到極大限制。

食管癌多階段演進過程中產生的腫瘤相關抗原自身抗體可在患者出現主要臨床癥狀之前的數月甚至數年即被檢測到[9]。聯合檢測多種抗腫瘤相關抗原抗體對惡性腫瘤高危人群篩查和早期診斷具有一定的可行性[10-11]。本研究主要基于食管癌分子分型液體活檢技術，優化組合出5種腫瘤相關抗原自身抗體(CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65)聯合檢測方法，通過食管癌患者與正常對照人群研究指標診斷的可靠性，并在食管癌高發區小規模人群中進行驗證，之后將其在食管癌高發區獨立的大規模無癥狀人群進行推廣應用。

本研究結果顯示：第1組的早期食管癌患者的5種腫瘤相關抗原自身抗體聯合檢測陽性率為77.00%，驗證組中食管癌和癌前病變的陽性率分別為72.73%和75.86%，在推廣應用組中有相似的結果。這提示利用血清腫瘤相關抗原自身抗體聯合液體活檢技術對食管癌高發區無癥狀人群進行檢測，是一種非常有前景的食管癌高危人群篩查和早期診斷方法。這3組人群腫瘤相關自身抗體聯合檢測時均存在一定的假陰性率，可導致食管癌前病變和早期癌漏診，提示未來我們的研究應進一步關注多種腫瘤標志物的優化組合，提高聯合診斷敏感性。在第3組食管癌高發區無癥狀人群大規模推廣應用中，通過對腫瘤相關自身抗體陽性者進一步行色素內鏡檢查發現，與單純色素內鏡檢查的食管癌檢出率相近。提示該方案在無癥狀人群大規模推廣應用中具有顯著的篩查診斷潛力。

總之，這是一項多中心、多階段的大規模人群研究，主要基于食管癌分子分型液體活檢技術，優化組合出5種腫瘤相關抗原自身抗體(CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65)聯合檢測方法，精準確定出食管癌高危人群，具有與色素內鏡篩查相似效果，但極大減少了內鏡篩查人數，節約了篩查成本，可作為食管癌高危人群預警和早期診斷的關鍵手段，在食管癌高發區無癥狀人群大規模篩查中應用具有明顯的社會效益和臨床意義。