上調miR-145對Th9細胞分化及相關因子表達的影響①

韋 茜 黃尤藝 張湘蓮 姜海行 覃山羽

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科,南寧 530021)

惡性腹腔積液(malignant ascites，MA)是由多種因素共同作用的結果，常見于卵巢癌、肝癌、胃癌等疾病的晚期階段，目前其形成機制尚不完全清楚。除了腫瘤細胞外，MA中還含有大量的免疫細胞，如淋巴細胞(主要是CD4+淋巴細胞)、巨噬細胞、粒細胞等，發生MA時，它們被有選擇性地募集到腹腔，進而發揮生物學作用[1,2]。Th9細胞是CD4+輔助性T 細胞亞群，可由轉錄生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)和IL-4在體外刺激誘導初始CD4+T 細胞獲得，主要分泌IL-9 和IL-10，具有免疫調節、促炎、抗腫瘤等效應[3，4]。本課題組前期研究顯示Th9細胞在MA的發展過程中發揮重要作用，而anti-IL-9處理可以延長小鼠MA 模型的中位生存期[5，6]。

微小RNA145(miR-145)是微小RNA家族的一員，miR-145在多種癌癥中普遍下調，其通過靶向多種癌基因調控細胞周期、增殖、凋亡和侵襲等[7]。研究顯示卵巢癌患者MA中的miR-145 表達下調[8]。此外，Lam等[9]研究顯示在卵巢癌小鼠模型中，激活miR-145可抑制卵巢腫瘤的生長和轉移，從而減少MA產生。Wang等[10]研究顯示在實驗性重癥肌無力大鼠模型中，過表達miR-145可抑制Th17 細胞的分化。目前miR-145 的研究多集中在腫瘤細胞，但對MA 免疫微環境中的miR-145 與Th9 細胞之間的關系及其作用機制鮮有報道。因此，本研究重點探討上調miR-145對Th9細胞及相關因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠(6～8周，雌性)，體質量18～22 g，SPF級，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK(桂)2014-0002。RPMI1640細胞培養基，胎牛血清(美國Gibco)；青鏈霉素(北京索萊寶)；Recombinant Human TGF-β1，Recombinant Mouse IL-4(美國R&D)；EasySepTMMouse Na?ve CD4+T Cell Isolation Kit(加拿大StemCell)；Stain Buffer(FBS)，Fixation/Permeabilization Solution Kit，anti-Mouse CD3e，anti-Mouse CD28，AlexaFluor647標記anti-Mouse IL-9抗體，PerCP-Cyanine5.5標記anti-Mouse CD4抗體，Leukocyte Activation Cocktail，流式細胞儀FACSCantoⅡ(美國BD)；TransIT-TKO轉染試劑(美國Mirus)；miRNeasy Micro Kit(德國QIAGEN)；miRNA逆轉錄試劑盒，miRNA qPCR Kit(北京天根生化科技)；mRNA逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa)；TRIzol Reagent，mRNA RT-PCR試劑盒(美國Thermo Fisher)；小鼠IL-9 ELISA 檢測試劑盒(武漢華美生物工程)；miR-145-5p mimic，miR-145-5p mimic Negative Control (韓國 Bioneer)。

1.2方法

1.2.1脾臟單細胞懸液制備及初始CD4+T細胞的分選 參考Pham[11]的方法，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌環境中解剖小鼠，分離脾臟置于盛有預冷的5 ml RPMI1640完全培養基的培養皿中，用1 ml注射器尾部研磨脾臟，用吸管輕輕反復吹散細胞，將組織研磨液用200目尼龍網過濾，以1 500 r/min離心5 min 棄上清，用1 ml紅細胞裂解液重懸裂解紅細胞，1 min后立即加入20 ml培養基終止反應，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀用PBS溶液重懸，細胞計數，再離心留細胞沉淀。用含2%胎牛血清的PBS重懸形成1×108個/ml濃度的細胞懸液。按試劑盒說明書進行細胞免疫磁珠分選。分選后的細胞用流式細胞術檢測CD4+T細胞的純度。

1.2.2Th9細胞的體外誘導分化 參考Humblin等[12]的方法，將初始CD4+T細胞種植于預先包被anti-CD3(2 μg/ml)的96孔板中，加入anti-CD28(2 μg/ml)、IL-4 (20 ng/ml) 和TGF-β(2 ng/ml)誘導為Th9細胞，對照組Th0細胞不加IL-4、TGF-β，各組細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基中置于37℃、5%CO2條件下培養3 d。72 h后收集細胞，用流式細胞術、RT-PCR進行分析。

1.2.3細胞體外轉染 取初始CD4+T細胞隨機設置為實驗組、對照組和空白組，按1×105個/孔細胞接種于96孔板。實驗組和對照組細胞內分別轉染miR-145 mimic、miR-145 mimic NC，空白組不轉染。基因轉染步驟按TransIT-TKO轉染試劑說明書進行，轉染后24 h收集各組細胞應用RT-PCR檢測miR-145表達水平。

1.2.4流式細胞術檢測CD4+T細胞純度及Th9細胞誘導比例 加入Leukocyte Activation Cocktail (2 μl/ml)刺激細胞，37℃、5%CO2培養4～6 h后收集細胞并計數，按1×105個/管分裝至流式管中，1 500 r/min離心5 min，PBS洗1遍，離心后棄上清，用100 μl PBS重懸細胞，加入PerCP-Cyanine5.5 標記CD4抗體，4℃避光染色20 min，PBS洗1遍，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入Fixation/Permeabilization固定/破膜液250 μl，室溫固定30 min，加入2 ml Perm/Wash液洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清，以50 μl Perm/Wash液重懸細胞，加入AlexaFluor647標記IL-9抗體，室溫避光染色30 min，Perm/Wash洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清，用200 μl PBS重懸后用流式細胞儀檢測。

1.2.5ELISA檢測Th9細胞上清液IL-9的分泌水平 轉染后的細胞誘導分化3 d，收集細胞培養上清液，檢測IL-9的分泌。按照試劑盒說明操作，加入配好的標準品和樣品，37℃溫育2 h，倒掉液體，加生物素標記抗體混勻，37℃溫育1 h，洗3次，加辣根過氧化物酶標記的親和素工作液，37℃溫育1 h，洗5次，加TMB底物，37℃溫育15～30 min，加終止液終止反應，5 min內讀板，450 nm波長檢測吸光度。

1.2.6RT-PCR 檢測細胞miR-145、NFATc1 mRNA、IL-9 mRNA及Smad3 mRNA表達水平 細胞轉染24 h后收集各組細胞，按miRNeasy Micro Kit說明書提取細胞miRNA，并按miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit說明書進行逆轉錄合成，反應條件：42℃ 60 min、95℃ 3 min(1個循環)。按照miRcute Plus miRNA qPCR Kit說明書進行實時熒光定量RT-PCR檢測，擴增條件：95℃ 15 min(1個循環)，94℃ 20 s、64℃ 30 s、72℃ 34 s(5個循環)，94℃ 20 s、60℃ 34 s(43個循環)。以U6為內參照基因，采用2-ΔΔCt計算miR-145的相對表達量，miR-145及U6特異性引物均由生工公司設計合成，miR-145上游引物序列為5′-ACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。于轉染后24 h收集細胞檢測NFATc1 mRNA，于轉染并誘導3 d后收集細胞檢測IL-9 mRNA及Smad3 mRNA，按TRIzol試劑操作說明書提取細胞總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行逆轉錄，反應條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s(1個循環)。按照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix說明書進行實時熒光定量RT-PCR檢測。擴增條件：UDG酶激活95℃ 2 min(1個循環)，預變性95℃ 2 min (1個循環)，95℃ 15 s、60℃ 1 min (40個循環)。以GAPDH為內參照基因，采用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

2 結果

2.1Th9細胞誘導分化比例 分選后的細胞用流式細胞術檢測比例為(91.4±2.7)%，獲得高純度的初始CD4+T細胞。按Th9、Th0細胞誘導條件培養72 h后，分別檢測兩組的細胞標志物，結果顯示，Th9組CD4+IL-9+細胞比例高于對照Th0組[(10.9±2.0)% vs (2.22±0.2)%,P<0.05]， 差異有統計學意義，Th9細胞誘導成功，見圖1。

圖1 CD4+細胞純度及Th9細胞誘導流式分析Fig.1 Flow cytometry analysis of CD4+ cell purity and Th9 cellsNote:Naive CD4+T cell were differentiation under a Th9 cell-inducing conditions for 3 d,and then CD4+T cells were first gated on FSC and SSC to remove debris and conjugates,Th9 cells were defined as CD4+IL-9+ subpopulations by flow cytometry.Compared with Th0 group,*.P<0.05.

2.2細胞轉染后miR-145的表達情況 轉染24 h后分別提取各組細胞miRNA，并逆轉錄得到相應cDNA，以其作為模板對miR-145進行擴增。結果顯示，與轉染miR-145 mimic NC組和對照組相比，轉染miR-145 mimic組細胞miR-145表達水平均顯著增高，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 RT-PCR分析轉染后miR-145的表達Fig.2 RT-PCR analysis of miR-145 expression after transfectionNote:Naive CD4+T cells were transfected with miR-145 mimic or miR-145 mimic NC,RT-PCR analysis of miR-145 expression after 24 h,**.P<0.01.

2.3miR-145可抑制Th9細胞標志物的表達 細胞轉染后誘導分化72 h， 檢測各組細胞標記物CD4+

IL-9+，實驗結果顯示CD4+IL-9+細胞的比例為：miR-145 mimic組(3.24±1.66)%、miR-145 NC組 (7.84±1.92)%、對照組(8.58±2.36)%。結果顯示轉染miR-145 mimic組的細胞CD4+IL-9+表達較轉染miR-145 mimic NC組和對照組均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 流式細胞術分析轉染后誘導的Th9細胞Fig.3 Flow cytometry analysis of Th9 cells after transfectionNote:Naive CD4+T cells were transfected with miR-145 mimic or miR-145 mimic NC,and then polarised under Th9 conditions 3 d,analysed by flow cytometry,*.P<0.05.

2.4miR-145可抑制CD4+T細胞NFATc1的mRNA表達 轉染24 h后分別檢測miR-145 mimic組、miR-145 mimic NC組細胞NFATc1 mRNA表達，結果顯示，與轉染miR-145 mimic NC的細胞相比，轉染miR-145 mimic細胞的NFATc1 mRNA表達水平降低(t=-4.932,P<0.01),差異具有統計學意義，見圖4A。

圖4 miR-145對Th9細胞分泌IL-9及IL-9 mRNA和Smad3 mRNA表達的影響Fig.4 Effects of miR-145 on expression of IL-9,IL-9 mRNA and Smad3 mRNA in Th9Note:A.RT-PCR analysis of NFATc1 mRNA expression after transfection,**.P<0.01;B.The supernatant was collected and the IL-9 secretion was detected with ELISA,**.P<0.01;C.RT-PCR analysis of IL-9 mRNA and Smad3 mRNA expression,ns.P>0.05,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.5miR-145可抑制Th9細胞IL-9的分泌 細胞轉染24 h后，刺激誘導分化為Th9細胞，3 d后收集細胞上清分別檢測各組細胞IL-9泌水平，結果顯示：轉染miR-145 mimic組(107.1±9.6)pg/ml，轉染miR-145 mimic NC組(173.8±9.9)pg/ml，對照組(185.0±5.1)pg/ml。結果顯示組間整體比較差異有統計學意義(F=73.2,P<0.01)，多重比較顯示：轉染miR-145 mimic組的細胞IL-9表達水平比轉染miR-145 mimic NC組和對照組均顯著減少(P<0.01)，差異具有統計學意義，見圖4B。

2.6miR-145可抑制Th9細胞IL-9的mRNA表達 各組轉染后的細胞刺激誘導72 h，分別檢測IL-9、Smad3的mRNA 表達水平，結果顯示，組間整體比較差異均有統計學意義(IL-9:F=11.428,P<0.01；Smad3:F=6.033,P<0.05)。與轉染miR-145 mimic NC組和對照組相比，轉染miR-145 mimic組的IL-9的mRNA表達水平降低(P<0.05)；與對照組相比，轉染miR-145 mimic組的Smad3的mRNA表達水平下降(P<0.05)，差異均具有統計學意義。而與轉染miR-145 mimic NC組相比，轉染miR-145 mimic組細胞的Smad3的mRNA 表達降低(P>0.05),差異無統計學意義。實驗結果證實上調miR-145可抑制Th9的IL-9的mRNA表達，見圖4C。

3 討論

Th9細胞是新近被發現和確認的CD4+細胞的一個亞群，其可由Th2細胞在TGF-β刺激下獲得，也可在體外由小鼠初始CD4+T細胞在TGF-β和IL-4共同刺激下誘導產生，主要分泌IL-9效應因子，能夠激發炎癥反應，參與多種免疫性疾病的病理生理過程[3,13]。在本研究中，從小鼠脾臟細胞分選初始CD4+T細胞后經誘導分化培養，CD4+IL-9+細胞比例較未誘導細胞明顯增高，與Wang等[14]結果基本一致。

Th9細胞分化涉及多種轉錄因子調控，編碼細胞因子IL-9 的基因是Il9，調控Il9 基因轉錄的調節因子包括PU.1、IRF1、IRF4、STAT5、STAT6、NFAT、GATA-1、GATA3、Smads、Etv5、Notch 以及NF-κB、AP-1等[15]。Jash等[16]研究顯示T 細胞受體活化激活了核因子NFAT 和NF-κB,促進其核定位和Il9 基因的表達,協同促進Th9 細胞分化。NFATc1是NFAT家族的一員，Peng等[17]研究發現NFATc1調控T和B細胞的活化與分化，NFATc1缺失則導致淋巴細胞增殖受損，淋巴細胞的分化也受到抑制。此外，在Th9調控中，Smad3是TGF-β受體的下游信號，TGF-β/Smad信號途徑可以激活IL-9的表達，Smad2、3 和4 缺失時，明顯抑制Th9 細胞分化[18]。這些結果都提示NFATc1、Smad3在Th9細胞的分化機制中起重要作用。

MicroRNAs是一種內源性的小型(18～25個核苷酸)非編碼RNA，通過抑制翻譯或降低mRNA的穩定性在轉錄后水平調控基因表達。miR-145在多種癌癥中普遍下調，通過靶向多種癌基因調控細胞周期、增殖、凋亡和侵襲等多種細胞過程[7]。Wang等[10]證實了過表達的miR-145可降低CD4+T細胞中NFATc1蛋白表達水平，從而影響Th17細胞表達。本研究同樣觀察到過表達miR-145可抑制CD4+T細胞中NFATc1的mRNA水平，同時Th9細胞的分化和細胞因子分泌也受到了抑制，因此推測miR-145通過抑制CD4+T細胞的NFATc1從而影響Th9細胞分化。同時，本研究觀察到過表達miR-145可影響Th9細胞Smad3的mRNA表達。Megiorni等[19]結果表明Smad3是 miR-145的潛在靶基因，miR-145可負調控Smad3的表達。Liu等[20]發現在HK-2 細胞中miR-145 可抑制TGF-β依賴的Smad 信號通路活性。因此，miR-145是否通過影響TGF-β/Smad信號通路而影響Th9細胞分化尚不清楚，今后將進一步研究miR-145影響 Th9分化的具體機制。

綜上所述，本研究顯示上調miR-145可抑制Th9細胞分化和IL-9分泌水平。