氟西汀對抑郁癥模型小鼠Treg細胞的影響①

馬博乙 張 靜 吳玉婷 張博文 曹雅明 李 成

(中國醫科大學免疫學教研室，沈陽 110000)

抑郁癥是臨床上常見的精神障礙性疾病之一，其發病率高，流行病學統計顯示抑郁癥在我國發病率高達5%。抑郁癥具體的發病機制仍然不是非常明確。最近，關于抑郁癥與免疫之間的相關研究有了突飛猛進的發展。有人提出抑郁癥可能是由細胞因子分泌引起的免疫系統改變，并且已經在抑郁患者中觀察到T輔助(Th)細胞和相關細胞因子的變化，例如血漿中IFN-γ增加，CD4/CD8比率增加和淋巴細胞對有絲分裂原的增殖反應降低等[1]。此外在抑郁癥患者中發現Th1/Th2細胞因子的比例更加偏向Th1細胞因子；血漿IFN-γ/IL-4比例(Th1/Th2比率)水平均較高[2]。然而，也有研究表明，抑郁癥患者和對照組之間的外周血淋巴細胞和T淋巴細胞亞群的數量沒有差異[3]。因此，CD4+T細胞在抑郁癥中的確切表現和作用還有待研究。

目前臨床上用于治療單相抑郁癥的藥物主要為選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRIs)，代表藥物是氟西汀。相關研究表明，氟西汀可減少絲裂原誘導的T淋巴細胞增殖[4]。另外，在正常小鼠中用氟西汀治療4周后，發生T細胞介導的免疫增強[5]。所以T細胞在抑郁癥發展中的作用以及T細胞和其亞群的狀態仍有待確定。本實驗通過目前已被廣泛接受的慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)法制備小鼠抑郁癥模型，并選用氟西汀治療，探討氟西汀對抑郁癥小鼠T細胞亞群及相關細胞因子的影響，為治療抑郁癥拓展新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，8周齡，體質量20～24 g，購自沈陽艾科賽斯生物科技有限公司。

1.1.2試劑和儀器 氟西汀(Sigma公司)；FoxP3等抗體(Bioss公司)；酶標儀，流式細胞儀(Thermo公司)；免疫組化試劑盒(UltraSensitive S-P超敏試劑盒)、DAB顯色試劑盒(邁新生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1CUMS抑郁模型建立 本實驗采用CUMS建立抑郁模型[6，7]。將空籠17 h、斜籠45° 17 h、濕籠17 h、食物剝奪14 h、夜間光照12 h、熱水游泳5 min、飲水剝奪16 h、夾尾5 min共8種刺激隨機安排到28 d內，每日2種，同種刺激不連續出現，使小鼠不能預料刺激的發生。對照組正常飼養，未給予刺激。

1.2.2實驗分組及給藥方法 實驗前適應性喂養1周，室內溫濕度恒定，通風良好，自由進食。正常飼養，未給予刺激的小鼠為A組(每組6只)：對照組。正常小鼠給予氟西汀注射(6只)為B組。CUMS建模結束后，將CUMS組小鼠分為2組(每組6只)分別為C組：CUMS模型組；D組：CUMS模型+氟西汀組。CUMS建模28 d后，A組和C組：給予生理鹽水0.5 ml/d腹腔注射；B組和D組：每天給予氟西汀10 mg/kg溶于0.5 ml生理鹽水中腹腔注射，治療持續3周。

1.2.3行為學評價 建模開始前和建模結束后分別進行小鼠的行為學測定。①體質量測量：于8∶00進行小鼠體質量測量。②攝食實驗：早上9∶00添加食物約20 g，次日9∶00稱食物余量，同時稱動物體質量，計算24 h攝食比[攝食比=(食物總量一食物余量)/體質量×100%]。③糖水偏好測試實驗：該實驗是用來檢測抑郁模型中快感缺失的指標，快感缺乏是抑郁癥患者的核心癥狀之一[8]。具體操作為：首先進行糖水適應的訓練，前24 h每個鼠籠放置兩瓶1%蔗糖水，24 h后將其中的一瓶換為純水。適應之后進行測試：每籠各放置 1% 蔗糖溶液和純水各一瓶，小鼠自由取水，禁食。12 h后測量剩余液體體積，記錄蔗糖水、純水及總液體消耗，計算糖水偏好。糖水偏好百分比(%)=糖水消耗量/液體總消耗量×100%。

1.2.4樣品采集 給藥結束后，每組取3只小鼠取眼球血，室溫自然凝固60 min，2 000 r/min離心20 min，仔細收集上清，-20℃保存備用。每組再取3只小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露心臟，以等滲生理鹽水經左心室灌注沖洗后，用4%多聚甲醛溶液灌注，結束后取脾臟，置于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.2.5流式細胞術 檢測脾組織中調節T細胞(regulatory cells,Treg)的活化作用，選取脾細胞1×107個放入含有50 ng/ml PMA和1 mmol/L ionomycin的24孔板在5% CO2，37℃條件下刺激6 h，并加入Golgi stop reagent(2 μmol/L)用以封閉細胞因子的分泌。Tregs細胞標記選取(CD4+CD25+Foxp+Treg細胞)，細胞培養之后，取所有脾細胞先進行FITC-anti-CD4和PerCP-anti-CD25細胞膜表面染色，在固定和透膜后用APC-anti-Foxp3抗體進行細胞內染色，其固定及透膜方法如上所述。染色結束細胞PBS洗滌后重懸4℃保存，待流式細胞儀檢測。所有染色細胞用FACSCalibur流式細胞儀進行分析，各組均設抗體單標記及陰性對照，細胞檢測數為1×105個。用FlowJo軟件進行數據分析。

1.2.6免疫組化 取固定結束的脾臟組織制作蠟塊及切片(厚度5 μm)，常規脫蠟脫水，免疫組化染色采用UltraSensitive S-P超敏試劑盒，DAB顯色，脫水封片。數據處理采用Image-Pro-Plus 6.0分別計數陽性細胞比例。

2 結果

2.1行為學評價 應激前(實驗第0天)CUMS組小鼠體質量、攝食比、糖水偏好與對照組均無明顯差異(P>0.05)，應激后CUMS組的體質量、攝食比、糖水偏好均明顯低于未進行應激實驗的對照組(第28天)，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明CUMS抑郁建模成功，如表1。

表1 實驗第0天及第28天對照組與CUMS建模組小鼠體質量、攝食比、糖水偏好測定Tab.1 Body weight,food consumption ratio and sucrose preference stress in control group and CUMS model group were measured at 0 day and 28

2.2CUMS模型組及氟西汀治療組脾臟形態學改變 脾組織HE染色發現CUMS組脾組織結構發生明顯改變脾臟白髓萎縮，脾索結構不清晰，脾小梁斷裂，如圖1。

圖1 HE染色Fig.1 HE stainingNote:*.White pulp.

2.3免疫組織化學技術檢測Treg細胞亞群變化 免疫組化結果顯示，CUMS模型組Foxp3陽性率明顯高于CUMS+氟西汀治療組和對照組(P<0.05)；CUMS+氟西汀治療組Foxp3陽性率略高于對照組；正常鼠給予氟西汀治療后Foxp3陽性率比對照組明顯增加(P<0.05)，如圖2、表2。

表2 脾臟免疫組化Foxp3陽性率細胞百分比Tab.2 Percentage of positive cells positive for Foxp3 in

圖2 CUMS抑郁癥模型組、氟西汀治療組及對照組Foxp3免疫組化染色Fig.2 CUMS depression model,fluoxetine-treated group and control group Foxp3 immunohistoche-mical stainingNote:A.Control+fluoxetine-treated;B.Control group;C.CUMS+fluoxetine-treated group;D.CUMS group.

2.4流式細胞術檢測檢測Treg細胞數量 流式細胞術實驗結果顯示，CUMS組小鼠與對照組相比Treg細胞占CD4+T細胞百分比無顯著差異(P>0.05)；而CUMS+氟西汀治療組明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，如表3及圖3。

表3 脾臟中Treg細胞數量占CD4+T細胞百分比Tab.3 Number of Treg cells in the spleen accounts for percentage of CD4+T

圖3 CUMS抑郁癥模型組及氟西汀治療組 Treg細胞亞群的改變Fig.3 Changes of subpopulation of Treg cells in CUMS depression model group and fluoxetine-treated group

3 討論

T細胞是體內發揮免疫功能的關鍵免疫細胞，根據其表面分子表達不同，可以分為CD4+T細胞和CD8+T細胞，其中CD4+T細胞主要發揮輔助和調節功能，故也稱為輔助性T細胞，可分為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17 和Treg等。之前有研究表明，輕度的應激會激活Th2細胞，相反，長期反復的刺激壓力會激活Th1細胞[9]。近年來，Th17和Treg細胞之間的平衡受到了越來越多的關注。Th17細胞可以促進小鼠的自身免疫，并且與人類炎癥性疾病的發病機制有關，而Tregs控制由正常菌群引發的免疫反應和炎癥[10]。有研究表明，在CUMS誘導的抑郁癥模型小鼠體內Th17及Treg細胞亞群發生改變，但該研究沒有繼續研究CUMS小鼠使用抗抑郁藥物后的T細胞亞群的變化[11]。Tregs，也稱為抑制性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+Tregs)，可抑制過度的免疫應答并介導免疫耐受。

在本實驗中，使用CUMS法誘導抑郁癥的小鼠模型并使用氟西汀對其進行治療，小鼠的體重及糖水偏好實驗證實CUMS法誘導抑郁癥模型有效。氟西汀治療小鼠與正常小鼠行為學評價發現，治療小鼠的糖水偏好沒有差異即快感消失癥狀有改善。

HE染色觀察脾臟形態發現CUMS組小鼠脾臟結構發生明顯改變，白髓萎縮，脾索結構不清晰，脾小梁斷裂。猜測免疫器官正常形態和功能的改變是造成重度抑郁癥患者免疫力下降的重要原因。免疫組化結果顯示：CUMS+氟西汀治療組和對照組Foxp3陽性率均明顯低于CUMS模型組；正常鼠給予氟西汀治療后Foxp3陽性率比對照組明顯增加，猜測抑郁癥發生過程中小鼠免疫應答處于抑制狀態，可以解釋情緒低落時人疾病易感性增強，而在氟西汀治療后這種抑制狀態被打破。流式細胞術發現，CUMS組小鼠與對照鼠相比Treg細胞占CD4+T細胞百分比無顯著差異(P>0.05)；而CUMS+氟西汀治療組明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，文獻報道，在CUMS的后期階段，CD3+CD8-IL-17+的Th17細胞的比例顯著降低[12]。同時，在Treg特異性轉錄因子Foxp3 mRNA的檢測中發現其表達含量升高，尤其在第14天發生了顯著增加。提示Tregs可能是參與抑郁癥免疫抑制的關鍵細胞類型。但在該文獻中，CUMS第21天時抑郁癥模型組與對照組Treg細胞百分比與對照組無明顯差異，提示Treg細胞在抑郁癥模型組發揮功能具有時間限制性。結合本實驗的結果，表明 Treg細胞除了受時間限制外，也很大程度上受到氟西汀治療的影響。此外，還發現給予正常小鼠氟西汀后小鼠脾臟中的Treg細胞明顯增加，可能是由于Foxp3不僅僅表達在Treg細胞中造成陽性率有增高，還可能氟西汀增強免疫后小鼠體內CD4+免疫細胞總數有明顯增加所致[13，14]。

綜上所述，在小鼠CUMS抑郁模型中，行為學的改變可能與Treg細胞的比例失調相關。這些發現為Treg細胞在抑郁癥中的作用提供了新角度，并且為抑郁癥的治療提供了新靶點。研究T細胞亞群與神經因子之間的關系將有助于理解免疫細胞在抑郁癥中發揮的作用。