干擾lncRNA FLVCR1-AS1表達通過靶向調控miR-381-3p抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

石曦雯 金 賀 羅衛民

(廣州市中西醫結合醫院病理科，廣州 510800)

前列腺癌是發生于前列腺的上皮性惡性腫瘤，其主要治療方法有手術、放化療、內分泌治療等，但晚期患者無法治愈，隨著分子生物學的發展，靶向基因治療成為惡性腫瘤治療的新方法[1]。研究發現長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與前列腺癌形成、進展和轉移密切相關，異常表達的lncRNA可通過表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控等影響前列腺癌的生物學行為[2]。貓白血病病毒C亞類受體反義RNA1(feline leukemia virus subgroup C receptor antisense RNA1，FLVCR1-AS1)是一種lncRNA，在膽管癌組織和細胞系中高表達，抑制FLVCR1-AS1表達可抑制膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲[3]。沉默FLVCR1-AS1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)在細胞生物學過程中發揮重要作用，調控前列腺癌發生與發展[5]。研究報道伊卡利汀可通過調節miR-381-3p及其靶基因UBE2C表達對前列腺癌起抑制作用[6]。miR-381-3p在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中低表達，過表達miR-381-3p可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[7]。但lncRNA FLVCR1-AS1在前列腺癌細胞中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制是否與miR-381-3p相關目前尚未闡明。本文研究FLVCR1-AS1和miR-381-3p對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及FLVCR1-AS1是否通過miR-381-3p影響細胞增殖、遷移和侵襲，為前列腺癌細胞早期診斷和治療提供新思路、新方法和新靶點。

1 材料與方法

1.1材料 正常前列腺上皮細胞株 RWPE-1和前列腺癌細胞株DU145、LNCaP、22Rv1購自北京北納創聯公司；RPMI1640培養基、胎牛血清購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑、MTT試劑盒購自美國Invitrogen公司；BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell小室、Matrigel膠購自美國Bio-Rad公司；抗體均購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自翊圣生物公司；載體質粒均購自上海伯易生物科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 正常前列腺上皮細胞株RWPE-1和前列腺癌細胞株DU145、LNCaP、22Rv1用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO2下培養，1 d/次換液，待細胞融和至約80%時，加入胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細胞處理與分組 取對數生長期細胞DU145，將si-NC、si-FLVCR1-AS1、miR-NC、miR-381-3p、pcDNA、pcDNA-FLVCR1-AS1分別轉染至DU145細胞，分別記為si-NC組、si-FLVCR1-AS1組、miR-NC組、miR-381-3p組、pcDNA組、pcDNA-FLVCR1-AS1組；將si-FLVCR1-AS1質粒分別與anti-miR-NC、anti-miR-381-3p共轉染至DU145細胞，分別記為si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC組、si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p組。具體轉染步驟按照Lipofecta-mineTM2000試劑盒說明書進行。

1.2.3RT-qPCR檢測miR-381-3p和FLVCR1-AS1表達 提取總RNA，反轉錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進行PCR檢測，miR-381-3p和FLVCR1-AS1分別以U6和GAPDH為內參，各樣品設3個重復，循環條件為95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-381-3p F：5′-TACTTAAAGCGAGGTTGCCCTT-3′，R：5′-GGCAAG-CTCTCTGTGAGTA-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAG-CACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FL-VCR1-AS1 F：5′-AGGGTTCTTGGGTCTACTTCAG-3′，R：5′-TGAGGACTTGCACTCTCTAACG-3′；GAPDH F：5′-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3′，R：5′-GAGTGATTTTCCCGTCC-3′。

1.2.4Western blot檢測CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達 各組細胞培養48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次；加入二抗室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，ECL發光法染色，ChemiDoc XRS+系統成像，Quantity One凝膠分析軟件處理，檢測各組蛋白條帶吸光度，蛋白相對表達水平=目的條帶吸光度/GAPDH條帶吸光度。各蛋白樣品設3個重復。

1.2.5MTT檢測細胞活性 各組細胞培養24、48、72 h時，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，37℃培養4 h；1 000 r/min離心10 min，棄培養液，每孔加150 μl DMSO振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀檢測490 nm處吸光度。細胞活性(%)=(OD實驗組-OD空白組)×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 無血清培養基重懸細胞，調整細胞濃度為2×104個/ml。遷移實驗：取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，37℃培養48 h，去除培養液后用棉簽擦去上層細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，結晶紫染色細胞數即為遷移細胞數。侵襲實驗：將Matrigel膠與培養液以1∶4 混勻后平鋪于Transwell小室上室，室溫下干燥凝固后，按遷移實驗步驟操作，顯微鏡下觀察結晶紫染色細胞數即為侵襲細胞數。

1.2.7熒光素酶報告實驗檢測FLVCR1-AS1對miR-381-3p的靶向調控 構建FLVCR1-AS1的3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-FLVCR1-AS1和MUT-FLVCR1-AS1，用LipofectamineTM2000將WT-FLVCR1-AS1和MUT-FLVCR1-AS1分別與miR-NC和miR-381-3p共轉染至DU145細胞，按照說明書進行檢測。結果以熒光素酶活性和Renilla活性比值進行統計學分析，重復3次。

2 結果

2.1lncRNA FLVCR1-AS1和miR-381-3p在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的表達 與正常前列腺上皮細胞RWPE-1相比，前列腺癌細胞DU145、LNCaP、22Rv1中FLVCR1-AS1表達顯著升高，miR-381-3p表達顯著降低(P<0.05，表1)。提示在前列腺癌細胞中FLVCR1-AS1呈高表達，miR-381-3p呈低表達。

表1 FLVCR1-AS1和miR-381-3p在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的表達Tab.1 Expressions of FLVCR1-AS1 and miR-381-3p in prostate cancer cells and normal prostate epithelial

2.2干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖的影響 與si-NC組(1.02±0.09)相比，si-FLVCR1-AS1組DU145細胞中FLVCR-AS1表達(0.43±0.04)降低(P<0.05)，細胞活性、CyclinD1表達降低，p21、p27表達升高(P<0.05，表2、圖1)。提示干擾FLVCR1-AS1表達可抑制前列腺癌DU145細胞增殖。

圖1 干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖相關蛋白表達的影響Fig.1 Interfering with expression of FLVCR1-AS1 on expressions of proliferation-related proteins in pros-tate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05.

表2 干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖的影響Tab.2 Effect of interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation of prostate cancer DU145

2.3干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-FLVCR1-AS1組DU145細胞遷移和侵襲數顯著減少，MMP-2、MMP-9、MMP-14表達顯著降低(P<0.05，圖2、3)。提示干擾FLVCR1-AS1表達可抑制前列腺癌DU145細胞遷移和侵襲。

圖2 干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞遷移、侵襲的影響(×200) Fig.2 Effect of interference with FLVCR1-AS1 expre-ssion on migration and invasion of prostate cancer DU145 cells(×200)

圖3 干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響Fig.3 Interfering with expression of FLVCR1-AS1 on expressions of migrative and invasive related proteins in prostate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05.

2.4miR-381-3p過表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC組(0.99±0.09)相比，miR-381-3p組DU145細胞miR-381-3p表達(2.48±0.25)顯著升高(P<0.05)，細胞活性顯著降低，遷移和侵襲細胞數顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達顯著降低，p21表達水平顯著升高(P<0.05，表3、圖4、5)。提示miR-381-3p過表達可抑制前列腺癌DU145細胞增殖、遷移和侵襲。

圖4 miR-381-3p過表達對前列腺癌DU145細胞遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-381-3p overexpression on migration and invasion of prostate cancer DU145 cells

圖5 miR-381-3p過表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of miR-381-3p overexpression on expressions of proliferation,migration and invasion related proteins in prostate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05.

表3 miR-381-3p過表達對前列腺癌DU145細胞增殖的Tab.3 Effect of miR-381-3p overexpression on prolif-eration of prostate cancer DU145

2.5lncRNA FLVCR1-AS1靶向調控miR-381-3p表達 Targetscan軟件預測顯示FLVCR1-AS1與miR-381-3p存在結合位點(圖6)。熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC組(1.02±0.09)、(1.00±0.08)相比，miR-381-3p組轉染WT-FLVCR1-AS1的DU145細胞熒光素酶活性(0.38±0.04)顯著降低(P<0.05),而轉染MUT-FLVCR1-AS1的DU145細胞熒光素酶活性(0.99±0.09)差異無統計學意義(P>0.05)。RT-qPCR檢測結果顯示，與pcDNA組(1.01±0.09)相比，pcDNA-FLVCR1-AS1組miR-381-3p表達(0.41±0.04)顯著降低，與si-NC組(1.00±0.09)相比，si-FLVCR1-AS1組miR-381-3p表達(2.53±0.25)顯著升高(P<0.05)。提示FLVCR1-AS1可靶向調控miR-381-3p表達。

圖6 FLVCR1-AS1序列中存在與miR-381-3p互補的核苷酸序列Fig.6 Sequence of FLVCR1-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-381-3p

2.6抑制miR-381-3p表達可逆轉干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移侵襲的作用 與si-NC組(1.01±0.09)相比，si-FLVCR1-AS1組DU145細胞miR-381-3p表達(2.56±0.25)顯著升高，細胞活性顯著降低，遷移和侵襲細胞數顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達顯著降低，p21表達顯著升高(P<0.05)；與si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC組(2.59±0.26)相比，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p組DU145細胞miR-381-3p表達(1.63±0.16)顯著降低，細胞活性顯著升高，遷移和侵襲細胞數顯著增加，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達顯著升高，p21表達顯著降低(P<0.05,表4、5，圖7、8)。提示抑制miR-381-3p表達逆轉了干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

表4 抑制miR-381-3p表達對干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖的影響Tab.4 Effect of inhibition miR-381-3p expression on interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation of prostate cancer DU145

圖7 抑制miR-381-3p表達對干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞遷移、侵襲的影響Fig.7 Inhibition of miR-381-3p expression interference with FLVCR1-AS1 expression on migration and invasion of prostate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05;compared with si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC group,#.P<0.05.

表5 抑制miR-381-3p表達逆轉干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的作用Tab.5 Inhibition of miR-381-3p expression reversed effect of interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation,migration and invasion-associated protein expressions in prostate cancer DU145

圖8 抑制miR-381-3p表達對干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響Fig.8 Effect of inhibition of miR-381-3p expression on interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation,migration and invasion-associated protein expressions in prostate cancer DU145 cellsNote:1.si-NC;2.si-FLVCR1-AS1;3.si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC;4.si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p.

3 討論

近年我國前列腺癌發病率逐漸上升，前列腺癌病情隱匿，發現時多已發生轉移。前列腺癌的分子靶向治療已取得重大進展，闡明前列腺癌的發生發展機制有助于前列腺癌治療[8]。大量研究表明lncRNA參與調控多種癌癥的發生發展過程。敲低lncRNA FLVCR1-AS1表達可通過miR-513/YAP1通路抑制卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化過程[9]。FLVCR1-AS1通過miR-155促進胃癌細胞增殖和侵襲，說明FLVCR1-AS1具有抑癌作用[10]。本研究結果顯示，FLVCR1-AS1在前列腺癌細胞中呈高表達，干擾FLVCR1-AS1表達后CyclinD1表達顯著降低，p21、p27表達顯著升高，MMP-2、MMP-9、MMP-14表達顯著降低，細胞活性和遷移、侵襲細胞數顯著降低。CyclinD1是細胞周期中正向調節因子，p21和p27是細胞周期素依賴性激酶的抑制因子，與細胞增殖相關[11,12]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族成員MMP-2、MMP-9、MMP-14與腫瘤侵襲、轉移相關[13]。本研究結果說明干擾FLVCR1-AS1表達可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。FLVCR1-AS1可作為前列腺癌分子治療的新靶點和診斷、預后新的生物標志物。

研究報道miR-381-3p在乳頭狀甲狀腺癌組織和細胞中表達下調，上調其表達可抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[14]。過表達miR-381-3p通過下調FGF7抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞周期阻滯和凋亡[15]。本研究結果顯示，前列腺癌細胞中miR-381-3p呈低表達，過表達miR-381-3p可降低細胞活性和遷移、侵襲細胞數，降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達，提高p21表達。說明過表達miR-381-3p可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。表明miR-381-3p在前列腺癌中起抑制作用。本研究還發現，FLVCR1-AS1靶向調控miR-381-3p表達，抑制miR-381-3p表達可逆轉干擾FLVCR1-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。說明FLVCR1-AS1可能通過調控miR-381-3p表達影響前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，干擾FLVCR1-AS1表達可通過上調miR-381-3p表達抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲，FLVCR1-AS1和miR-381-3p均參與前列腺癌進展，可通過調控其表達控制前列腺癌的惡性進展，為前列腺癌的診斷、治療和預后改善提供新的分子生物標志物和治療靶點。