內蒙古地區蒙古族哮喘患者外周血單個核細胞miR-34b-5p、miR-150水平及意義①

張 園 朱天吉

(內蒙古醫科大學附屬醫院呼吸內科，呼和浩特 010000)

哮喘是一種屬于全球性難治的慢性呼吸道炎癥反應疾病，以胸悶、喘息、咳嗽等反復發作為其臨床癥狀，發病率逐年上升，嚴重影響患者日常生活工作[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛分布于機體內各種細胞和組織中，且具有調節作用的一種小分子RNA，在多種疾病發生時異常表達，有望作為診斷多種疾病的臨床指標[2]。哮喘發生后，患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中miRNA表達失調[3]。微小RNA-34b-5p(microRNA-34b-5p，miR-34b-5p)在哮喘患者血清中呈高表達，可作為哮喘的臨床檢測指標及治療靶點[4]。Zhang等[5]研究顯示微小RNA-150(microRNA-150，miR-150)表達可抑制lncRNA BCYRN1表達，進而影響氣道炎癥反應。但miR-34b-5p、miR-150在內蒙古地區蒙古族哮喘患者PBMC中的表達水平及兩者聯合診斷哮喘的研究尚未發現相關研究報道。因此，本研究通過初步研究miR-34b-5p、miR-150在內蒙古地區蒙古族、漢族哮喘患者PBMC中的表達水平，分析兩者聯合診斷價值，以期為內蒙古地區蒙古族、漢族早期診治哮喘提供臨床參考資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般臨床資料 選取2013年1月～2014年1月本院確診的蒙古族哮喘患者120例為蒙古哮喘組，其中男58例，女62例；年齡23～64歲，平均年齡(43.02±10.68)歲。以同期本院就診的120例漢族哮喘患者為漢族哮喘組，其中男56例，女64例；年齡24～66歲，平均年齡(44.28±10.76)歲。并選擇同期健康體檢者120例(蒙古族63例，漢族57例)進行對照研究為健康組，其中男60例，女60例；年齡22～65歲，平均年齡(43.96±10.70)歲。三組在性別、年齡等方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

哮喘診斷標準：依據2012年中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的哮喘判定標準[6]。納入標準：①所有患者符合哮喘納入標準；②所有研究對象祖籍三代均居住于內蒙古地區；③無異族通婚史；④生理病理檢查資料完整者。排除標準：①患有糖尿病、高血壓、慢阻肺等慢性疾病者；②患有系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等自身免疫系統疾病者：③合并嚴重的慢性全身性疾病者；④合并急慢性感染者。哮喘嚴重程度分級：輕度：癥狀≥1次/周，但<1次/d，可能影響睡眠，夜間哮喘癥狀>2次/月，但<1次/周，FEV1≥預計值80%或PEF≥個人最佳值80%，PEF變異率為20%～30%。中度：每日有癥狀，影響活動和睡眠，夜間哮喘癥狀>1次/周，FEV1預計值60%～79%或PEF個人最佳值60%～79%，PEF變異率為>30%。重度：每日有癥狀，頻繁出現，夜間哮喘癥狀經常發生，體力活動受限，FEV1預計值60%或PEF個人最佳值60%，PEF變異率為>30%。

1.1.2主要試劑 Ficoll淋巴細胞分離液購于美國GE公司；TRIzol試劑盒、Reverse Transcription System試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix Kit均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1樣本采集及預處理 三組受試者于晨起空腹狀態下采集外周靜脈血6 ml，分別置于兩個管中，其中一個用于炎癥因子測量；另一份置于含有EDTA-K2抗凝管中，以Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離所有樣本PBMC，保存于-20℃冰箱中，待測。

1.2.2RT-PCR法檢測兩組PBMC中miR-34b-5p、miR-150的表達水平 取出-20℃冰箱中保存的PBMC樣本，冰上解凍，參照TRIzol試劑盒說明書加TRIzol裂解液，按其說明書具體操作流程從PBMC樣本中抽提總RNA。利用紫外分光光度計檢測抽提RNA樣本在波長260 nm、280 nm處的吸光度(A)，以A260/A280比值在1.8～2.0，表示抽提RNA樣本純度良好。以純度良好的RNA樣本為模板，依照Reverse Transcription System試劑說明書將其逆轉錄成cDNA。依據SYBR Green PCR Master Mix Kit試劑盒操作說明書配制目標PCR反應體系，將目標cDNA擴增、定量檢測。miR-34b-5p、miR-150均以U6為內參。以2-ΔΔCt法計算miR-34b-5p、miR-150相對表達量。各引物序列見表1。

表1 miR-34b-5p、miR-150及內參U6的引物序列Tab.1 Primer sequences of miR-34b-5p,miR-150 and internal reference U6

1.2.3檢測一秒用力呼氣流量(forced expiratory volume in one second,FEV1)占預測值的百分比(FEV1%) 所有受試者靜息30 min，利用肺功能儀行肺功能檢測 FEV1%，連續檢測3次求平均值。1.2.4ELISA檢測血清中炎癥因子水平 將試管中血液樣本進行離心后取上清液，檢測所有受試者全血中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13含量，按照對應試劑盒說明書操作步驟進行含量檢測。

2 結果

2.1各組miR-34b-5p及miR-150表達水平、肺功能指標、炎癥因子比較 漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者miR-34b-5p、IFN-γ、IL-2水平及FEV1%均明顯低于健康組，miR-150、IL-4及IL-13顯著高于健康組(P<0.05)；蒙古族和漢族患者IFN-γ、IL-2水平及FEV1%比較無顯著差異(P>0.05)；蒙古族miR-34b-5p水平顯著低于漢族；而miR-150、IL-4及IL-13水平顯著高于漢族(P<0.05)，見表2。

表2 各組miR-34b-5p及miR-150表達水平、肺功能指標、炎癥因子比較Tab.2 Comparison of miR-34b-5p and miR-150 expression levels,lung function indicators and inflammatory factors in each

2.2與疾病嚴重程度的相關性分析 根據所有哮喘患者疾病嚴重程度分為輕度(n=129)、中度(n=99)及重度(n=12)。以疾病嚴重程度為自變量(0=輕度，1=中重度)，以炎癥因子IFN-γ(實測值)、IL-2(實測值)、IL-4(實測值)、IL-13(實測值)、miR-34b-5p(實測值)、miR-150(實測值)、FEV1%(實測值)為自變量進行有序Logistic多元回歸分析，結果顯示miR-34b-5p為疾病嚴重程度的保護因素(OR=0.081，P=0.023)，而miR-150為疾病嚴重程度的危險因素(OR=20.898，P=0.015)，見表3。

表3 Logistic多因素回歸分析結果Tab.3 Logistic multivariate regression analysis results

2.3miR-34b-5p、miR-150表達水平預測內蒙古地區哮喘疾病的效能分析 對三種檢測方式對兩族哮喘患者診斷的結果顯示，兩族患者開展聯合檢測的診斷效能均顯著優于 miR-34b-5p及miR-150單一檢測(z=12.257,10.947,P<0.001)，見表4、圖1。

表4 PBMC中miR-34b-5p、miR-150表達水平及二者聯合預測蒙古族哮喘發生的效能Tab.4 Expression levels of miR-34b-5p and miR-150 in PBMC and their combined predictive efficacy in Mongolian asthma

圖1 PBMC中miR-34b-5p、miR-150表達水平預測漢族及蒙古族哮喘發生的ROC曲線Fig.1 ROC curve of miR-34b-5p and miR-150 expression levels in PBMC predicting occurrence of asthma in Han nationality and Mongolian asthma

3 討論

哮喘是由多種炎癥細胞、炎癥因子參與引發的呼吸系統疾病，以氣流受阻為臨床特征，可引起肺臟甚至全身癥狀，嚴重影響患者身心健康及社會正常活動[7]。因此，尋找可早期診治哮喘的可靠指標，對哮喘病情及時防控，是臨床醫學面臨的重要課題。

miRNA是機體內一類長度約22個核苷酸的RNA小分子，可參與并調節細胞增殖、信號轉導、免疫炎癥反應等生化過程[8]。Huang等[9]研究顯示miR-199a-5p在哮喘患者血漿中表達上調，與肺功能指標FEV1呈負相關，miR-199a-5p可調節炎癥過程，并進行信號傳導，從而促進哮喘疾病發生與發展。miR-98在哮喘患者外周B細胞中表達異常，與血小板反應蛋白1具有負相關性，兩者共同影響哮喘發病進展[10]。miR-1165-3p在哮喘患者血清中呈過表達，其可作為過敏性哮喘的診斷標志物[11]。以上研究表明，miRNA表達異常與哮喘發作關系密切。miR-34在哮喘患者中下調，與自噬、纖維化、氣道炎癥、氣道重塑相關，miR-34是哮喘的潛在生物標志物和治療靶標[12]。Wang等[13]研究發現miR-34在慢性阻塞性肺病患者中表達下降，經白藜蘆醇治療后表達上調，表明miR-34可能參與并影響肺部炎癥反應過程。miR-34b-5p在哮喘患者血清中表達下調，其具有哮喘臨床診斷價值[4]。本研究中漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者PBMC中miR-34b-5p水平均低于健康組，提示miR-34b-5p在哮喘發病進展中起一定作用。miR-150在慢性阻塞性肺病中表達異常，其可能通過影響肺部炎癥和氣道上皮細胞，進而影響慢性阻塞性肺病的發生、發展[14]。miR-150在髖部骨折引發的全身性炎癥和急性肺損傷血清中表達異常，可作為髖部骨折后急性肺損傷診斷和預后的可靠生物標志物[15]。以上研究表明，miR-150在肺部炎癥疾病中表達異常，其可能參與并影響肺部炎癥類疾病。本研究中漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者PBMC中miR-150水平均明顯高于健康組，且蒙古哮喘組患者PBMC中miR-150水平明顯高于漢族哮喘組，提示miR-150可能在不同種族哮喘發生與發展中發揮不同程度的作用。

哮喘患者常伴有肺功能改變特征，肺功能檢測可作為哮喘鑒別診療的重要方法[16]。哮喘發生時，與其密切相關的淋巴細胞Th1、Th2分泌的炎癥因子水平發生變化[17]。本研究中漢族哮喘組和蒙古哮喘組患者FEV1%，外周血中IFN-γ、IL-2水平均明顯低于健康組，IL-4、IL-13水平明顯高于健康組，且蒙古哮喘組患者外周血中IL-4、IL-13水平及PBMC中miR-150明顯低于漢族哮喘組，提示同一地區哮喘患者肺功能指標、炎癥因子與健康組存在差異，肺功能指標、炎癥因子可能影響哮喘。根據既往動物模型研究結果顯示，miR-34b-5p是參與到巨噬細胞激活及極化的重要因素，過表達miR-34b-5p可以誘導巨噬細胞功能激活，從而導致炎癥介質的釋放[18]。而IL-4亦可以通過激活巨噬細胞參與到哮喘的發生和發展機制中，二者之間可能存在顯著關系，但具體機制尚不清楚，而根據本次研究推測，蒙古族哮喘患者由于miR-34b-5p高表達可導致巨噬細胞顯著極化，從而影響外周血中IL-4及IL-13的含量。同時還有研究結果顯示，敲除miR-150基因后會導致血液中性粒細胞含量顯著下降[19]，故可以認為此基因表達可以顯著促進炎癥反應，根據兩族患者之間miR-150表達情況來看，漢族患者miR-150表達量顯著高于蒙古族，提示蒙古族患者哮喘發生后炎性反應更加嚴重，這也證實了之前對于IL-4及IL-13的含量的研究結果。但上述均為筆者根據既往研究結果推測所得，其詳細機制還需要開展大量的基礎研究及臨床對照研究證實。

進一步研究發現，miR-34b-5p及miR-150是內蒙古地區哮喘患者疾病嚴重程度的獨立影響因素。為miR-34b-5p疾病嚴重程度的保護因素，而miR-150為疾病嚴重程度的危險因素。上述兩種miR與哮喘患者炎性因子的相關性在之前的研究已經被證實，而本結果提示上述兩組指標對哮喘疾病嚴重程度具有較好的判斷性，這與其在體內受疾病影響的敏感度較高，且受其他因素的影響較小有關。同時本研究還顯示，PBMC中miR-34b-5p、miR-150對內蒙古地區發生哮喘均有一定的診斷價值，但單獨診斷效能較低，兩者聯合能有效提升診斷的效能，但對于不同種族之間的二者診斷效能的比較還有待大樣本研究進行證實。

綜上所述，內蒙古地區蒙古族哮喘患者PBMC中miR-34b-5p表達下調，miR-150表達上調，兩者聯合對哮喘診斷具有較高的診斷價值。但本研究實驗樣本量較少，結果可能存在一定偏差，后期將加大研究樣本量進行深入研究。