良性前列腺增生患者前列腺組織及外周血Th1/Th2/Th17及相關細胞因子多參數檢測的臨床意義

張力杰 陳 明 朱偉東

(東南大學附屬中大醫院泌尿外科，南京 210009)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性高發疾病之一，早期無明顯癥狀，但隨著下尿路梗阻加重，可出現一系列下尿路癥狀(low urinary tract symptoms，LUTS)，如尿頻、尿急、尿失禁等。既往研究認為，BPH患者的LUTS發生原因主要可歸結為2類：靜態因素(前列腺體積增大)與動態因素(膀胱頸、前列腺平滑肌張力異常)[1]。近期研究發現，前列腺炎癥(prostatic inflammation，PI)可能是決定BPH相關性LUTS的另一重要因素，但其與LUTS的確切關系仍存在爭議[2]。PI常表現為尿路刺激癥狀等，其發病機制多與免疫功能下降、炎癥感染等相關，因其癥狀與BPH相似，臨床中往往難以區分，影響患者治療及預后[3]。研究發現，免疫-炎癥紊亂與PI密切相關，以活化T淋巴細胞研究最多，且證實輔助性T細胞(helper T cells，Th)參與前列腺疾病的發生發展，但關于Th1/Th2、CD4+T細胞在BPH及PI中的作用尚未完全明確[4]。本研究檢測BPH患者前列腺組織及外周血中Th1/Th2/Th17細胞及相關細胞因子表達情況，并區分伴或不伴PI患者的各因子表達水平，探討多參數聯合檢測在BPH診療中的意義，為BPH的多因子治療提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 收集2016年8月～2018年8月在我院接受外科手術治療的BPH患者120例為BPH組。納入標準：①符合手術指征并行尿道前列腺電切術治療，且術后病理檢查確診為BPH；②術前國際前列腺癥狀評分(IPSS)>13分；③年齡45～85歲；④手術病理及臨床資料完整。排除標準：①未經病理檢查證實為BPH者；②疑似或明確診斷為前列腺癌者；③存在前列腺手術史者；④存在PI史或反復尿路感染史者。另選擇同期且年齡與BPH組相匹配的健康志愿者40例作為對照組，均無急慢性感染、自身免疫性疾病及性傳播疾病，近6個月內無嚴重外傷史及手術史。所有受試者知情同意，研究經我院倫理委員會審核批準。

1.1.2儀器與試劑 FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD Bio-science公司)；2010型電化學發光免疫分析儀及配套試劑盒(美國羅氏公司)；PE標記IL-17A單抗、FITC標記CD4及CD25、APC標記CD127、PE標記的IFN-γ、IL-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-10抗體及其通行對照抗體、完全RPMI1640培養基(美國BD公司)；離子霉素、佛波酯(PMA)刺激劑(美國Sigma公司)；其余常規試劑為實驗室分析純。

1.2方法

1.2.1樣本采集 受試者隔夜空腹8 h以上，次日清晨取空腹靜脈血3 ml置于EDTA抗凝采血管內混勻，室溫下1 500 r/min離心5 min，吸取血漿分裝于凍存管，-80℃保存備用。

1.2.2CBA法檢測外周血Th1/Th2/Th17細胞因子水平 采用15 ml離心管，按照CBA Flex Set試劑盒制備細胞因子標準品(2 500 pg/ml)，按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度標記8個流式管，檢測稀釋液作用標準陰性對照。上述各管內分別加入稀釋液300 μl，并從原液管開始逐步按照相應比例稀釋。捕獲微球后分別取出10 μl，根據需要檢測的總樣本數計算總微球吸取體積=樣本數×10 μl。本次檢測7個因子即捕獲7種微球，混合后于200 g離心5 min，棄上清，血清增強液中重懸，振蕩混勻，室溫下避光保存30 min。各試管中加入捕獲微球混合品各50 μl，標準管中加入等量稀釋后的標準品，樣本管加入待測樣本50 μl，各試管中均加入人Th1/Th2/Th17藻紅蛋白檢測試劑各50 μl。室溫下避光孵育3 h，加入1 ml洗液離心5 min，棄上清，加入洗液300 μl進行微球重懸處理。渦旋振蕩3～5 s混勻，上機檢測，采用FCAP Array v3.0軟件繪制標準曲線并進行數據分析。

1.2.3外周血Th1/Th2/Th17細胞數量檢測 取抗凝血100 μl于試管中，加入等量無血清RPMI1640培養液(1∶1)，加入5 μl PMA工作液(1 μg/ml)、離子霉素工作液4 μl與6 μl莫能霉素工作液(0.1 mg/ml)混勻，37℃、5%CO2培養4～6 h。取出培養試管，加入20 μl CD4-FITC抗體于室溫下避光孵育20 min，加入BD固定破膜劑進行細胞固定破膜，室溫下避光孵育20 min，PBS洗滌1次，分別加入IFN-γ-APC、IL-4-PE-CY5與IL-17-APC-H7單抗混勻，室溫避光孵育30 min，350 g離心30 min，含1%FBS的PBS洗滌2次，棄上清。加入200 μl含1%FBS的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。按照上述步驟制備同型對照管，加入IgG1-FITC、IgG-PE抗體進行檢測，各管細胞數為20 000個，計算Th1/Th2/Th17細胞百分比，Flowjo 7.6.2 軟件分析數據。

1.2.4前列腺組織中IL-17蛋白表達檢測 BPH組患者在TURP術中采集病灶組織，采用4%甲醛固定、石蠟包埋并連續切片，切片厚度3 μm，HE染色。由2名經驗豐富的病理科醫生進行雙盲閱片，并根據國際前列腺炎組織學分類標準進行組織炎癥分級評價，分為無炎癥、輕度炎癥(組織內有散在炎癥細胞浸潤)、中度炎癥(聚集性分布炎癥細胞，但無腺體上皮組織損傷或淋巴樣小結節)、重度炎癥(聚集性炎癥細胞并形成淋巴樣小結節或伴腺體上皮組織損傷)[5]。采用免疫組化法測定組織中IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表達。細胞基質和(或)細胞核呈棕色顆粒沉著為陽性。選擇染色良好區域測定灰度值，采用Leica Q550CW圖像采集分析系統分析，選擇3張染色較好的切片置于顯微鏡下觀察(×400)，每張切片隨機選擇5個視野，測定單位面積內染色細胞(陽性)光密度值(A)作為蛋白表達，以β-actin為內參。

2 結果

2.1HE染色結果 BPH組HE染色鏡下可見腺體上皮細胞為簇狀增生或乳頭狀增生，上皮細胞體積較大，無明顯核仁，細胞質淡染，胞核呈短梭形，胞間界限模糊不清。91例符合PI標準，占75.83%，其中，輕度炎癥24例，中度炎癥49例，重度炎癥18例。

2.2各組一般資料比較 3組研究對象年齡、體重指數(BMI)差異無統計學意義(P>0.05)；BPH-PI組患者病程、前列腺體積、總前列腺特異性抗原(t-PSA)及IPSS評分顯著高于單純BPH組(P<0.05)，但單純BPH組的t-PSA與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of each group

2.3各組Th1/Th2/Th17細胞比例比較 與對照組相比，BPH組Th1細胞比例、Th1/Th2比值和Th17細胞比例明顯升高(P>0.05)且BPH-PI組變化更為顯著，Th2細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組Th1/Th2/Th17細胞比例比較Tab.2 Comparison of Th1/Th2/Th17 cell percentage in each group

2.4各組外周血Th1/Th2/Th17相關細胞因子水平比較 與對照組相比，單純BPH組和BPH-PI組外周血IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平顯著升高(P<0.05)，且BPH-PI組顯著高于單純BPH組(P<0.05)。見表3。

表3 各組外周血Th1/Th2/Th17相關細胞因子水平比較Tab.3 Comparison of levels of Th1/Th2/Th17 related cytokine in peripheral blood of each

2.5BPH患者前列腺組織中Th1/Th2/Th17相關細胞因子蛋白表達比較 BPH-PI組患者前列腺組織中IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表達顯著高于單純BPH組(P<0.05)。見表4。

表4 BPH患者前列腺組織中Th1/Th2/Th17相關細胞因子蛋白表達比較Tab.4 Comparison of Th1/Th2/Th17 related cytokine proteins expressions in prostatic tissues of BPH

3 討論

免疫學認為，男性生殖系統是免疫優勢系統，免疫性炎癥在BPH發病中的作用近年備受關注[6]。研究發現，BPH患者的病灶組織中存在組織學炎癥，主要為T淋巴細胞浸潤，推測自身免疫紊亂導致前列腺在內的生殖系統損傷可能是BPH及PI的發病基礎，而感染、創傷等屬于促進因素[7]。本研究中，75.83% BPH患者伴有PI，55.83%為中、重度炎癥，且伴有PI的BPH患者具有更長的病程、更大的前列腺體積、更高的t-PSA水平和IPSS評分，證實BPH患者普遍具有局部炎癥，但文獻報道僅5%～10% PI患者具有細菌感染證據，大部分患者的病因及病機尚未明確，同時，局部組織中免疫性炎癥是否會引起BPH患者組織、外周血中免疫細胞及相關細胞因子異常表達尚未明確[8]。

Th細胞是T淋巴細胞的主要亞群之一，按其分泌細胞因子的功能差異可分為Th1、Th2與Th17 3個亞群，其中，Th1/Th2平衡主要影響機體細胞因子網絡平衡，Th17細胞則具有雙向免疫調節作用，可正向調節NK細胞與Th1細胞功能而介導免疫反應，又可介導免疫逃逸、耐受與抑制等[9]。本研究中，BPH患者的Th1細胞比例顯著高于對照組，且BPH-PI組明顯高于單純BPH組(P<0.05)，Th2細胞略有升高差異無統計學意義(P>0.05)，但BPH患者的Th1/Th2比值明顯升高，且以BPH-PI組升高更為顯著。證實BPH患者中存在外周血Th1/Th2細胞失衡，且Th1占據相對優勢地位。Th17細胞是一種近期發現的CD4+T淋巴細胞，其作用機制與Th1/Th2具有較大差異，主要通過分泌IL-17等細胞因子參與機體自身免疫或炎癥反應[10,11]。本研究中，BPH患者外周血中Th17細胞比例較對照組明顯升高，且BPH-PI患者升高更為顯著(P<0.05)，提示Th17細胞過表達可能參與BPH的發生發展。

細胞因子是由免疫、炎癥細胞分泌的主要調節因子，促炎細胞因子是誘發免疫反應的關鍵因素，同時也可通過誘導免疫應答抗感染、腫瘤等。在炎癥狀態下，大量炎癥細胞因子及生長因子釋放可上調凋亡抑制因子(如bcl-2)表達，導致前列腺細胞大量增殖而發病[12]。因此，多種炎癥因子在機體免疫-炎癥系統中具有持續性、協調性、多效應性作用，多參數檢測具有重要意義。因傳統ELISA法一次性僅可完成1種細胞因子檢測，故本研究采用CBA技術進行一次性多參數檢測。Th1細胞分泌的IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-2均屬于炎癥調節因子，TNF-α、IFN-γ屬于促炎細胞因子，可誘導多種炎癥因子釋放，導致炎癥級聯反應，并可誘導炎癥細胞黏附、趨化與浸潤，還可抑制組織金屬蛋白酶(matrix metalloprote inase,MMP)抑制因子合成而引發MMPs過表達，導致局部組織中MMPs沉積而導致強烈炎癥反應[13]。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，其中，IL-4和IL-10可通過對IL-1、TNF-α等的抑制效應而發揮抗炎效應，并可降低前列腺組織中靶分子的穩定性而加速其降解，從而發揮清除炎癥的作用[14]。研究顯示，PI患者的外周血及精液中IL-10表達較健康對照組明顯升高，且其含量越高患者臨床癥狀越嚴重，原因可能為IL-10在T淋巴細胞與單核細胞中的表達與其他細胞因子表達相對滯后，在炎癥狀態下為抑制炎癥反應反饋性升高，證其對促炎細胞因子具有持續、反饋性抑制作用[15]。IL-6屬于多功能細胞因子，在正常生理狀態下可調節免疫應答并促進細胞增殖分化，在病理狀態下可誘導IL-2等細胞因子生成，可促進造血及細胞的增殖分化，激活免疫反應及NK、T、B細胞等，募集T細胞而擴大炎癥反應[16]。本研究中，BPH組患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平較對照組明顯升高，且BPH-PI組明顯高于單純BPH組(P<0.05)，與李云祥等[17]報道并不完全一致。而王磊等[18]研究顯示，61.11%的BPH患者伴有PI，且存在明顯的IL-6及TNF-α高表達，與本研究結論一致。因此認為Th1/Th2細胞及其相關細胞因子失衡所介導的免疫炎癥反應可能仍參與BPH發病過程，但具體機制有待深入研究。IL-17是由Th17細胞分泌的促炎細胞因子，IL-17A是其主要亞型，可作為前炎癥介質而誘導IL-1、TNF-α、IL-6等的釋放而放大炎癥反應，已被證實在自身免疫性疾病的發生發展中具有重要作用[19]。本研究中，BPH組患者血清IL-17A水平明顯高于對照組，且BPH-PI組顯著高于單純BPH組(P<0.05)。提示由IL-17A所介導的炎癥反應可能在BPH的發生發展中發揮重要作用。局部組織檢測顯示，BPH-PI患者的前列腺組織中IL-17A、IL-2、TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表達均高于單純BPH患者(P<0.05)，與蔣玉清等[20]報道結論相符。證實Th1/Th2/Th17相關細胞因子過表達可能參與BPH發生發展，且以IL-17A蛋白表達升高最為顯著，推測局部Th17細胞浸潤及其釋放的IL-17A所導致的炎癥反應可能在BPH的發生發展中發揮重要作用，但仍需進一步研究。

綜上所述，Th1/Th2/Th17細胞及其相關細胞因子表達失衡在BPH發生發展中具有重要作用，主要表現為Th2向Th1轉化和Th17過度活躍，且與多種細胞因子異常表達有關，在BPH-PI其患者中表現更為明顯。Th1/Th2/Th17細胞及相關細胞因子表達失衡可能通過局部或全身慢性炎癥在BPH發生發展中發揮特異性作用，多參數聯合檢測細胞因子水平對評價疾病免疫微環境或監測疾病的發生、發展及臨床治療具有重要參考價值。PI是BPH發生發展的結果或誘因，或兩者互為誘因，仍需繼續探討，但可以肯定的是伴發PI可加重BPH病情，臨床診療中應引起高度重視。