殺菌劑半抗原的合成及其免疫分析技術的研究進展①

曹嘯天 陳秀金 李兆周 仇彩霞 郭金英 王 耀

(河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471000)

在現代農業生產中，人們傾向于使用一些有保護植物作用的殺菌劑來提高作物產量，降低生產成本。然而，有些生產者由于受利益驅使長期濫用殺菌劑，造成了農產品中的殺菌劑殘留超標。研究表明：多種殺菌劑的低濃度殘留可能會對人類和其他動物造成不良后果，甚至誘發癌癥[1]。因此，需要嚴格控制農產品中的殺菌劑殘留量。為了更好地保障農產品的安全和消費者的利益，歐盟對農產品中殺菌劑的最大殘留限量進行了規定，如水果中殺菌劑的最大殘留限量0.05 mg/kg；谷物中殺菌劑的最大殘留限量0.01 mg/kg；蔬菜中殺菌劑的最大殘留限量0.05 mg/kg；堅果中殺菌劑的最大殘留限量0.05 mg/kg[2]。我國對農產品中殺菌劑最大殘留限量進行了限定，如水果中不同殺菌劑的最大殘留限量0.1～15 mg/kg；谷物中殺菌劑最大殘留限量為0.01～5 mg/kg；蔬菜中殺菌劑的最大殘留限量0.05～10 mg/kg；堅果中殺菌劑的最大殘留限量0.01～0.3 mg/kg[3]。

目前，氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法和高效液相色譜-串聯質譜法[4-13]等儀器分析法已廣泛用于殺菌劑殘留檢測，這些方法靈敏度高、準確性好，但需要昂貴的儀器、專業的操作人員、大量的有機溶劑和繁瑣的樣品前處理，無法滿足現場檢測需求[14]。而免疫分析技術正好可以彌補上述不足，具有簡單快速、經濟實用、靈敏度高和特異性強的優點[15]。本文對用于殺菌劑檢測的免疫分析法和儀器分析法進行比較[16]，結果見表1。

表1 免疫分析法和儀器分析法的比較Tab.1 Comparison of immunoassays and instrumental methods

免疫分析技術的靈敏度主要取決于抗體的質量，而半抗原的設計和合成對抗體質量好壞起到決定性作用。因此，本文對殺菌劑半抗原的合成及免疫分析技術在殺菌劑殘留檢測中的應用進行綜述。

1 殺菌劑半抗原的合成

半抗原的設計要求既要盡可能保留分析物的化學結構，還要盡量減少對分析物的空間構象和電荷分布的影響。下面按照殺菌劑種類不同分別對半抗原合成進行介紹。

1.1三唑類殺菌劑半抗原的合成 三唑類殺菌劑是目前生產上廣泛應用的一類殺菌劑，具有廣譜、高效和內吸性強等優點[17]，其共同結構是主碳鏈上含有羥基(或酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基，其半抗原的合成途徑有5種，一是對三唑類殺菌劑分子中的羰基(或羥基)進行修飾，如Newsome等[18]通過還原分子中的羰基得到羥基，然后與琥珀酸酐反應得到三唑酮的半抗原。Jiang等[19]在烯唑醇分子的羥基上引入四碳間隔臂，合成相應的半抗原。Cao等[20]用4-溴甲基-苯甲酸把多效唑分子上的羥基氧化為羧基，獲得相應的半抗原。王明明等[21]采用琥珀酸酐和多效唑分子上的羥基進行反應，合成了多效唑的半抗原。二是對三唑類殺菌劑分子中的氰基進行修飾，如Székács等[22]將腈菌唑分子中的氰基水解成氨基得到相應的半抗原。三是對三唑類殺菌劑苯環上的氯原子進行取代，如Danks等[23]采用羥基和氨基分別取代戊唑醇苯環上的氯原子合成了戊唑醇的半抗原1和半抗原2，四是利用三唑類殺菌劑的代謝物為原料合成半抗原，Forlani等[24]以氟醚唑的代謝物為原料合成半抗原。五是利用從頭合成途徑合成半抗原；Liu等[25]采用1-氯-3-(4-氯苯氧基)苯為原料，合成了苯醚甲環唑的兩種半抗原。其中半抗原1的結構含有苯醚甲環唑的部分結構，而半抗原2的結構含有苯醚甲環唑的完整結構。

1.2酰苯胺類殺菌劑半抗原的合成 酰苯胺類殺菌劑是一類內吸傳導性殺菌劑，其中大多數品種對卵菌綱病害有優異的防效。酰苯胺類殺菌劑半抗原的合成途徑有3種：一是通過水解殺菌劑制備半抗原，如研究者Rosso[26]和Newsome[27]分別通過水解苯霜靈和甲霜靈分子中的甲基得到苯霜靈和甲霜靈的半抗原；二是利用從頭合成途徑合成半抗原，如劉蓉蓉等[28]從頭合成了菌核凈的半抗原戊二酸半酯；三是以殺菌劑為原料進行衍生，如Watanabe[29]等直接對氟酰胺分子的甲基末端進行衍生得到羧基，合成了氟酰胺半抗原。

1.3酰亞胺類殺菌劑半抗原的合成 酰亞胺類殺菌劑是含有酰亞胺結構的有機化合物，用于殺滅種子上病原菌和葉面病原菌。酰亞胺類殺菌劑半抗原的合成途徑有2種：一是通過置換殺菌劑苯環上的氯原子制備半抗原，如Liu等[30]用6-氨基己酸取代百菌清分子苯環上的氯原子得到百菌清的半抗原。二是利用目標物的結構類似物為原料合成半抗原，如王松等[31]利用四氫鄰苯二甲酰亞胺和鄰苯二甲酰亞胺為原料，分別與5-溴戊酸發生取代反應，得到克菌丹的半抗原。

1.4苯胺基嘧啶類殺菌劑半抗原的合成 苯胺基嘧啶類殺菌劑具有高效性和低毒性的優點，對灰葡萄孢所致的各種病害有特效。其半抗原的合成途徑有3種情況：一是以殺菌劑為原料合成半抗原，如Esteve等[32]以嘧菌胺為原料，經過兩步反應合成半抗原1，同時以1-碘-3-硝基苯和2，4-二氯-6-甲基嘧啶為原料合成半抗原2。二是以殺菌劑結構類似物為原料合成半抗原。如姜震等[33]以2-氯-4,6-二甲基嘧啶和4-硝基苯胺為起始原料，經過3步反應得到的產物與琥珀酸酐反應，在分子中引入羧基得到嘧霉胺的半抗原。三是利用從頭合成途徑合成半抗原，如Esteve等[34]從頭合成了2種半抗原。

1.5其他類殺菌劑半抗原的合成 Mercader等[35,36]研究了醚菌酯和肟菌酯為原料，經堿水解合成了兩種半抗原。Mercader等[37]設計了氟唑菌酰胺的2種半抗原，半抗原1是以3-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯為原料，經過6步反應，用間隔臂取代目標物吡唑環上的甲基獲得的；半抗原2是以氟唑菌酰胺為原料經過5步反應，用六碳羧基手臂取代目標物吡唑環上的二氟甲基獲得的。Ceballos等[38]制備了2種含有羧基活性基團的半抗原，分別是用五碳羧化脂肪族直鏈取代吡唑N-甲基基團制成的和是用間隔臂取代了噻吩環鄰位上的支鏈4-甲基戊-2-基取代基制成的。李瀟瀟[39]等以噻呋酰胺分子部分結構2-甲基-4-三氟甲基-5-噻唑甲酸作為半抗原。

2 免疫分析技術

2.1ELSA ELISA作為一種快速檢測大量樣品的方法，被成功地用于殺菌劑殘留的檢測。本文總結了檢測殺菌劑殘留的抗體類型、半數抑制濃度和ELISA的檢測限見表2。

由表2可知，近十年來，國內外研究者主要應用單克隆抗體建立了檢測殺菌劑殘留的ELSA方法，方法的IC50均低于19.6 μg/ml,最低檢測限達到了0.01 ng/ml，遠遠低于歐盟和我國規定農產品中殺菌劑的最大殘留限量。對殺菌劑殘留的檢測樣品不僅有水果、蔬菜和谷物，還包括了環境土樣和水樣，添加回收率范圍在70%-130%。這些研究表明，ELISA已經廣泛用于殺菌劑殘留的檢測。從表2還可以得出，目前研究者建立單一殺菌劑殘留檢測的ELISA比較多，關于殺菌劑多殘留檢測的ELISA比較少，但是農產品中往往是多種殺菌劑同時殘留，由此將來需要研究對多種殺菌劑殘留同時檢測的ELISA。

表2 ELISA用于檢測殺菌劑殘留Tab.2 ELISA for detection of fungicide residues

2.2免疫層析法 免疫層析法(immunochromato-graphy assay，ICA)是20世紀80年代初發展起來的一種涵蓋了免疫分析、標記和層析的綜合科學技術，根據示蹤標記物將ICA分為量子點免疫層析法、膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay,GICA)等。所謂量子點ICA是以量子點為標記物的ICA，已用于戊唑醇的檢測。如Wang等[63]開發了基于量子點珠的熒光免疫層析試紙條，用于快速靈敏地檢測農產品中的戊唑醇殘留，檢測限為0.02 ng/ml。GICA是以金納米粒子為標記物的免疫層析法，已廣泛地用于殺菌劑的快檢。如Luo等[64]采用應對蘋果中的異菌脲進行檢測，檢測限為25 ng/ml。Yang等[65]運用EICA試紙條對黃瓜中的百菌清殘留進行檢測，消線值小于100 ng/ml，使用讀卡器定量檢測時，檢測限為91.78 ng/ml。袁寶鳳等[66]對比了甲霜靈和吡蟲啉殺菌劑試紙條和色譜法的檢測結果。表明甲霜靈膠體金試紙檢測結果與色譜儀檢測結果具有很好的相關性。樓小華等[67]采用EICA對煙葉中三唑酮和三唑醇殘留量進行快速檢測，檢測限為1 mg/kg。Xing等[68]應用ICA檢測飲用水中的百菌清殘留，消線值為5 ng/ml。由于GICA具有快速、簡單、便攜性強、可用于現場檢測等顯著優點，將會受到越來越多的關注[69]。

2.3時間分辨熒光免疫分析法 時間分辨熒光免疫分析方法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是以具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物，建立的一種新型的非放射性微量分析技術。該方法也已開始用于殺菌劑殘留的分析檢測。例如王明明等[21]建立了檢測多效唑的TRFIA法，線性檢測范圍是0.067-23.05 ng/ml，IC50為1.09 ng/ml，檢測限為0.012 ng/ml，同ELISA相比，靈敏度提高了19.6倍。Sheng等[70]以銪(Eu3+)和釤(SM3+)作為熒光標記物，研制了一種高靈敏度的雙標TRFIA，用于檢測食品中的噻蟲胺和烯唑醇。在優化后的條件下，得到噻蟲胺的IC50和檢測限分別為5.08 ng/ml和0.021 ng/ml，烯唑醇的IC50和檢測限分別為13.14 ng/ml和0.029 ng/ml。與傳統的ELISA相比，TRFIA法的靈敏度更高，穩定性更好，動態范圍更寬，試劑保存期更長，無放射性危害，在國際上被公認為現代標記免疫的最佳方法之一[71]。

2.4免疫傳感器 免疫傳感器(immunosensor，IA)是基于抗原抗體特異性識別功能而研制成的一類生物傳感器，現已應用于殺菌劑殘留的檢測。如Hirakawa等[72]利用IA對蔬菜中的百菌清殘留量進行檢測，定量檢測范圍為8.0～44 ng/ml，IC50為25 ng/ml。另外，Mauriz等[73]應用表面等離子共振IA對果汁中吡唑菌胺酯進行分析，方法的檢測限低至15 ng/ml，在蔬菜中的回收率75%～90%。Hirakawa等[74]也研制了檢測蔬菜中啶酰菌胺的表面等離子體共振IA，方法檢測限為15～93 ng/ml。IA縮短了分析時間，提高了方法的靈敏度和測試精準度，也簡化了測定過程，易于實現自動化，具有廣闊的應用前景。

3 存在問題與展望

3.1半抗原的設計 目標物半抗原分子設計的合理性是免疫分析方法中抗體制備的關鍵。然而，大部分殺菌劑中原本的設計是通過反復的動物免疫試驗來驗證，具有很大的盲目性。近十年來，免疫學家正嘗試通過引入分子模擬技術，預測半抗原設計的可行性，大大提高了半抗原設計的科學性。

3.2免疫試劑的穩定性 近年來，免疫產品的應用與開發受到抗體穩定性的制約。一方面，新型小分子抗體的發展，可以在一定程度上解決抗體試劑的穩定性。如納米抗體因具有較好的耐熱穩定性和耐有機溶劑的性質，可以更好地用于免疫產品的開發。另外，研究者利用分子印跡技術制備仿生抗體也能夠很好地彌補生物抗體的穩定性不足，促進免疫分析的發展。

綜上所述，分子模擬技術的引入、新型小分子抗體和仿生抗體的研究和發展，能夠較好地解決免疫分析技術應用時存在的問題。另外，近年來還出現了免疫分析方法和納米材料(熒光納米材料)的結合，不僅可以提高免疫分析方法的靈敏度，還可以拓寬方法的檢測范圍。因此，隨著免疫分析技術和其他技術的不斷結合和發展，檢測分析技術將會朝著綠色、快速、多殘留、高靈敏、低成本和商品化的方向發展，將會在殺菌劑殘留檢測中發揮著越來越重要的作用。