胰高血糖樣肽1對非酒精性脂肪肝大鼠CFHR1～5表達的影響

彭隨風 時昭紅

(武漢市第一醫院，武漢 430022)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與高胰島素血癥、2型糖尿病(T2DM)、肥胖密切相關的臨床病理綜合征，是代謝綜合征在肝臟的表現，與心腦血管疾病的發生密切相關[1]。近年來，隨著我國人民生活水平和飲食結構不斷提高和改善，NAFLD發病率不斷增加，廣東、北京、上海等地的普查顯示，NALFD發病率達10.0%～35.8%，T2DM中的發病率高達80.0%[2-3]。NAFLD可進展為肝硬化或肝癌，而且NAFLD常伴有高血脂、高尿酸、高血壓、冠心病等，增加患者心腦血管疾病發生率和全因死亡風險，成為威脅人群健康和生命的重要疾病[4-5]。鑒于胰島素抵抗是NAFLD和T2DM發病的共同基礎，增加胰島素敏感性、改善胰島素功能是治療NAFLD和T2DM的重要方式，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是腸促胰島素作用的主要因素，GLP-1是一種腸促胰島素，具有促進胰島素釋放、延緩胃排空、減低體重和降低食欲等生理作用。然而，單天然的GLP-1很不穩定，可被二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，半衰期僅1～2 min。若采用天然GLP-1來降低血糖，需持續靜脈輸注或持續皮下注射，臨床可行性較差。利拉魯肽為GLP-1代表性類似物，通過和白蛋白結合，既保留了天然GLP-1的功效又延長了作用時間，又對改善胰島β細胞功能、胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂具有明顯作用，在NAFLD中顯示出良好的肝臟保護作用[6]。補體系統是機體固有免疫的重要組成部分，與肝臟脂質的沉積發生密切相關，脂肪肝患者存在血清補體C3、C5水平升高，有學者認為補體可作為脂肪肝病情評估的監測指標[7]。補體因子H(CFH)是重要的補體調節物質，控制C3轉化酶的生成和穩定性，在早期的補體活化中發揮重要作用[8]。雖然目前國內外研究顯示利拉魯肽可通過改善糖脂代謝的方式保護NALFD肝功能，但其是否對NAFLD補體系統存在影響尚未見報道。本研究通過建立T2DM合并NAFLD大鼠模型并給予GLP-1干預，觀察GLP-1對補體因子H相關蛋白(complement factor H-related protein，CFHR)1～5水平的影響，進一步探討GLP-1對NAFLD的可能作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠48只，6～8周齡，體重(200±20)g，購自山東大學實驗動物中心，動物生產許可證號[SCXK(魯)2018-032]，山東大學實驗動物中心使用許可證號[SYXK(魯)2018-093]，遵循實驗動物使用的3R原則，本研究經過山東大學實驗倫理委員會批準(批號：2018-0041)。

1.1.2主要試劑與儀器 CFHR1～5酶聯免疫試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；GLP-1(利拉魯肽)購自諾和諾德(中國)制藥有限公司；三酰甘油及膽固醇試劑盒購自北京中生北控；高糖高脂飼料由江蘇協同生物有限公司提供；鏈脲佐菌素購自上海源葉生物；HE染色試劑盒購自碧云天；微量血糖儀購自羅氏；TS100光學顯微鏡購自奧林巴斯；油紅O購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1研究方法 隨機選擇8只大鼠作為對照組，給予普通飲食，其余40只大鼠給予高糖高脂飲食(普通飼料60.5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2%，蛋黃粉1.5%，豆油6%)，連續飼喂4周，一次性注射30 mg/kg的鏈脲佐霉素(對照組同期注射等量生理鹽水)，繼續高糖高脂飲食飼喂4周，空腹尾靜脈采血測量空腹血糖并計算胰島素敏感指數，以FPG>11.1 mmol/L且ISI降低作為成模標準，共成模26只，余大鼠剔除。將26只大鼠隨機分為模型組和觀察組，觀察組給予利拉魯肽100 μg/kg皮下注射，模型組和正常對照組均給予等量生理鹽水皮下注射，干預時間4周。期間注意觀察大鼠的毛發改變、食欲、大小便、活動、體重等變化，根據大鼠的體重調整劑量。

1.2.2觀察指標 最后一次給藥后禁食12 h，稱取體重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血10 ml，采用全自動生化儀檢測血脂、血糖和肝功能指標，ELISA檢測CHFR1-5水平，采用免疫散射比濁法檢測補體C3、C4、C5和BF水平，取血后快速取出完整肝臟，取部分肝組織用10%甲醛溶液固定，進行常規石蠟包埋，切片1 μm，常規HE染色，先在低倍鏡下觀察肝臟大體情況，再調至高倍鏡下觀察；另取部分肝臟組織冰凍，進行油紅O染色，采用撈片染色法，肝細胞脂肪病變范圍通過半定量進行評估，根據肝細胞腺泡結構測算脂肪變的肝細胞百分比：5%～33%為輕度脂肪變，34%～66%為中度脂肪變，>66%為重度脂肪變。

2 結果

2.13組補體水平比較 模型組和觀察組C3、C4、C5、BF水平均高于對照組，觀察組C3、C4、C5、BF水平均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.23組CHFR1～5水平比較 模型組和觀察組大鼠CHFR1、CHFR2、CHFR3、CHFR4、CHFR5水平均高于對照組，觀察組大鼠CHFR1、CHFR2、CHFR3、CHFR4、CHFR5水平均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.33組大鼠糖代謝指標比較 模型組和觀察組大鼠FBG、HOMA-IR水平均顯著高于對照組，觀察組大鼠FBG、HOMA-IR水平均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.43組大鼠脂代謝指標和肝功能指標比較 模型組和觀察組大鼠TG、TC、ALT、AST水平均高于對照組，觀察組TG、TC、ALT、AST水平均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.53組大鼠肝臟病理改變 對照組大鼠肝小葉中央靜脈周圍肝板結構排列規則，肝索間可見肝竇，肝細胞未見腫脹及脂肪變性，肝小葉結構完整，未見破壞及硬化等改變；與對照組相比較，模型組大鼠肝組織內出現大小不等的脂肪空泡，細胞核被擠向周邊，部分可見散在壞死灶及炎癥細胞浸潤；觀察組與模型組相比較肝臟脂肪組織病變減輕，胞漿脂滴減少，肝功能結構較完整，肝索排列較清晰。HE染色結果見圖1，油紅O染色結果見圖2。半定量結果顯示，模型組肝臟脂肪病變程度高于對照組和觀察組，觀察組肝臟脂肪病變程度低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表3 3組大鼠糖代謝指標相比較

表1 3組補體水平相比較

表2 3組CHFR1～5水平相比較

表4 3組大鼠脂代謝指標和肝功能指標相比較

圖1 3組大鼠肝臟組織HE染色結果Fig.1 HE staining results of of liver tissue in three groupsNote:A.Control group;B.Model group;C.Observation group.

圖2 3組大鼠肝臟組織油紅O染色結果Fig.2 Oil red O staining results of liver tissue in three groups of ratsNote:A.Control group;B.Model group;C.Observation group.

表5 肝細胞脂肪病變的半定量分析結果

3 討論

臨床上將排除酒精和其他明確因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積疾病稱為NAFLD，包括單純脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化，T2DM是以胰島素抵抗為特征的糖代謝紊亂性疾病，NAFLD和T2DM發病機制尚未完全闡明，但胰島素抵抗是二者發病的關鍵因素已經得到共識，改善胰島素抵抗是治療T2DM和NAFLD的有效方式[9]。研究顯示，口服負荷劑量胰島素后，腸因性胰島素分泌占人體總胰島素分泌的50%～70%，T2DM患者存在腸促胰島素作用受損，基于腸促胰島素的藥物可改善胰島素功能[10]。GLP-1是人體內腸源性激素，在胰腺β細胞中，GLP-1以葡萄糖濃度依賴性的方式作用于胰島素β細胞，促進胰島素基因轉錄，增加胰島素合成和分泌，增加葡萄依賴性胰島素反應性，保護β細胞，改善胰島素抵抗[11]。既往研究顯示，GLP-1除對胰腺作用外，還可通過促進靶組織糖原合成、抑制胃排空、抑制食欲、減少胃腸吸收、降低血漿游離脂肪酸等方式改善糖脂代謝[12]。陳五一等[13]研究顯示，GLP-1類似物利拉魯肽可改善NAFLD大鼠的脂代謝紊亂和胰島素抵抗，激活MAPK途徑逆轉肝細胞變性。邢冬杰等[14]研究采用免疫組織化學法檢測了利拉魯肽對NAFLD合并T2DM大鼠糖脂代謝和細胞凋亡的影響，結果顯示，利拉魯肽可降低NAFLD合并T2DM大鼠FBG、HOMA-IR、TC、TG水平，并能上調凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達，下調凋亡促進蛋白Bax，抑制肝細胞凋亡。ZHANG等[15]報道采用利拉魯肽干預8周可明顯改善高脂誘導的低脂聯素水平載脂蛋白(Apo)E敲除小鼠肝臟脂肪的堆積，改善肝臟組織學形態，降低總脂質水平。本研究結果顯示，觀察組采用利拉魯肽治療4周后，FBG、HOMA-IR、TC、TG、ALT、AST水平均低于模型組，肝臟形態較模型組明顯改善，結果提示利拉魯肽可改善T2DM合并NAFLD大鼠模型的糖脂代謝水平，改善肝臟形態，與上述研究一致。

補體系統參與肝臟脂質沉積發生發展的過程，肝脂肪變性時過多的脂肪細胞可分泌多種炎癥因子，炎癥因子激活補體C3、C5并介導一系列炎癥反應，補體系統的激活又可抑制炎癥細胞凋亡，引起炎癥反應的級聯放大，加重肝臟脂質沉積和脂肪性變，形成惡性循環[16]。體外研究顯示，拮抗C3、C5補體激活可改善脂肪組織低水平炎癥反應和胰島素敏感性[17]。臨床研究顯示，健康體檢者肝臟中檢測不到補體成分活化，而高達74%的NAFLD患者肝組織中有C3活性成分和C4d沉積，在嚴重肝臟脂肪病變患者中更為顯著[18]。SEGERS等[19]一項肝組織活檢的研究顯示，NAFLD患者肝組織C3活化率顯著升高，C3轉化酶穩定因子P因子和C3a活化產物C3c沉積，且沉積與肝細胞炎癥水平呈正相關。本研究結果顯示，模型組大鼠補體水平顯著升高，與上述臨床和基礎研究一致，這些結果提示，補體激活在NAFLD中通過不同途徑廣泛激活，并與病情程度相關，給NAFLD的預防和治療提供了新的靶點。

劉永安等[20]研究顯示，血清補體C3、C5和激素ASP與肝炎、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病密切相關。補體C3激活途徑包括旁路途徑、抗體識別和經典途徑，三種途徑均可導致C3轉化酶產生，C3轉化酶可將C3分裂為C3b，C3b則可與CFH結合終止C3活化，抑制補體活化，而CFHR則可競爭性抑制CFH表面配體影響CFH對補體活化的抑制作用[21-22]。王俊等[23]在T2DM中的研究顯示，T2DM患者血漿中檢測到CFHR1多肽質譜強表達。沈麗芳等[24]對T2DM研究顯示，CFHR與TG呈正相關，與HDL-C呈負相關，該研究結果認為CFH通過補體旁路途徑，改變補體通路成分，CHFR水平升高是導致胰島素抵抗和糖代謝紊亂的重要機制。本研究結果顯示，模型組和觀察組CFHR1～5及補體系統水平均高于對照組，結果提示NALFD合并T2DM大鼠體內存在CFHR1～5表達水平升高，結果與王俊、沈麗芳等結果一致，這些結果均提示，NAFLD合并T2DM動物模型存在CFHR1～5水平升高和補體系統激活。本研究結果顯示，觀察組CFHR1～5和補體水平均低于模型組，結果提示，GLP-1類似物利拉魯肽對CFHR1～5和補體系統激活具有抑制作用。

綜上所述，GLP-1類似物用于NAFLD大鼠可降低CFHR1～5水平，抑制補體激活，改善糖脂代謝和肝功能，本研究因條件所限，僅觀察了GLP-1類似物對CFHR1～5水平和補體水平的影響，并未對GLP-1類似物通過何種機制影響CFHR1～5水平進行探討。經查閱國內外文獻，目前亦尚未見GLP-1類似物對CFHR作用機制的報道，GLP-1類似物影響CFHR作用機制的深入研究對NAFLD的防治具有重要的指導意義，也為下一步研究指明了方向。