PI3K/Akt信號通路在小檗堿聯合人參皂苷Rg3誘導鼻咽癌細胞凋亡中的調控作用

周芳亮，胡 晶，藺 婷，何 蘭，范婧瑩，羅晶婧，王賢文，何迎春,4，廖端芳

(湖南中醫藥大學 1. 中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室、2.湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室、 3.醫學院，4. 湖南省中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術研究中心，湖南 長沙 410208)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種鱗狀上皮細胞癌，高發于我國南方各省、東南亞地區以及北非。由于NPC原發病灶多在咽隱窩，解剖學位置特殊，發病過程隱匿，且其周圍淋巴組織較豐富，容易發生淋巴轉移，故70%的新診斷NPC病例已為晚期(III或IV期)，此類病人預后較差[1]。因此，尋求一種安全高效的治療方法和藥物是NPC臨床治療過程中迫切需要解決的問題。

中醫認為“氣虛染毒”是NPC的病因病機，益氣解毒是其治療原則[2-3]。黃連性寒，人參性溫，配伍同用，則一苦一甘，一攻一補，相反相成，相濟相佐，為益氣、解毒并用之法。小檗堿和人參皂苷Rg3是中藥黃連和人參的活性成分，近年來均被證實可通過抑制細胞增殖和侵襲，阻滯細胞周期以及誘導細胞凋亡等機制發揮抗癌作用[4-6]。將兩者組合使用既可繼承中藥復方配伍增效的傳統優勢，又能滿足成分清晰、質量可控的現代中藥開發要求，有望成為治療NPC的潛在藥物。我們的前期研究發現，小檗堿聯合人參皂苷Rg3可發揮協同抗NPC的作用[7]，但其具體機制仍未完全明了。PI3K/Akt信號能被細胞內多種物質(激素、生長因子、細胞外基質成分等)激活，使得下游靶蛋白發生磷酸化，從而在調控細胞的生長、存活、自噬和凋亡等方面發揮著重要的作用[8]。而目前尚無PI3K/Akt信號通路在小檗堿聯合人參皂苷Rg3抗NPC中的作用的研究。因此，為進一步探究小檗堿聯合人參皂苷Rg3抗NPC的作用機制，研究探討小檗堿聯合人參皂苷Rg3能否通過抑制PI3K/Akt信號通路，調控增殖、凋亡相關蛋白的表達，從而達到協同抗NPC的作用。該研究有助于我們進一步闡明小檗堿聯合人參皂苷Rg3抗NPC的協同效應及作用機制，為其臨床應用奠定基礎，同時可為益氣解毒類中藥的現代開發提供新方向。

1 材料

1.1 細胞株人鼻咽癌細胞株CNE2、6-10B購自北京北納創聯生物技術研究院，由本實驗室傳代培養。

1.2 藥物與試劑小檗堿(上海金穗生物科技有限公司，批號2086-83-1)；人參皂苷Rg3(上海金穗生物科技有限公司，批號14197-60-5)；SC79(MCE公司，批號HY-18749)；LY294002(MCE公司，批號HY-10108)；RPMI-1640培養基(Hyclone公司，批號SH30809.01B)；胎牛血清(Gibco，批號10099-141)；0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液(Beijing Solarbio公司，批號T1320)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(BD公司，批號556547)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀公司，批號CW0014S-500T)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(康為世紀公司，批號CW0022S)；蛋白Marker(Thermo公司，批號26616)；Hoechst 33342(翊圣生物科技有限公司，批號40731ES10)；anti-β-actin(CST，批號4970S)，anti-Survivin(CST，批號2808)，anti-PCNA(CST，批號13110)，anti-Bax(CST，批號2772)，anti-Bcl-2(CST，批號2870)，p-Akt信號通路抗體檢測盒(CST，批號9916S)，anti-PI3 p110a(CST，批號4249S)。

1.3 主要儀器倒置顯微鏡(CKX31)(Olympus公司)；CO2培養箱賀利氏HERAcell150i (賽默飛世爾公司)；全自動酶標分析儀(ELX800)(BioTek公司)；精密恒溫水槽(BWS-12)(上海一恒科學有限公司)；電熱恒溫干燥箱(202-1AB)(天津市泰斯特儀器有限公司)；實時無標記細胞功能分析儀(RTCA)(艾森生物科技公司)；熒光雙染流式細胞儀Cellometer Image Cytometer(K2)(Nexcelom公司)；熒光倒置光學顯微鏡及圖像采集系統(Olympus公司)；多功能熒光成像儀(LI-COR公司)。

2 方法

2.1 細胞培養將CNE2及6-10B細胞培養于含10%胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺和100 kU·L-1青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中。

2.2 藥物的配置將小檗堿、人參皂苷Rg3、順鉑、SC79、LY294002用DMSO溶解，分別制成相應濃度的藥物母液，分裝后-20 ℃避光保存；臨用時用RPMI 1640完全培養液稀釋，配成所需要的工作濃度。

2.3 實時無標記細胞功能分析儀(Real Time Cellular Analysis，RTCA)監測細胞增殖情況藥物單用：不同濃度的小檗堿(0、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1)和人參皂苷Rg3(0、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1)分別處理CNE2細胞，同時設置溶劑對照組(0.1% DMSO)、陽性對照組(順鉑，15 μmol·L-1)和空白組(只加培養液、不加CNE2細胞)。

藥物聯合：選擇0.125 IC50、0.25 IC50、0.5 IC50、IC50、2 IC50濃度的小檗堿和人參皂苷Rg3聯合處理鼻咽癌CNE2細胞，同時設置溶劑對照組、陽性對照組和空白組。

取對數生長期細胞，消化重懸為單個細胞，按照5×103個細胞/孔接種到RTCA專用細胞增殖檢測培養板，每個孔加入100 μL細胞懸液。待細胞指數(cell index，CI)達到1.0時按分組加入不同濃度的藥物。每個組設5個復孔，每孔加入藥物體積為200 μL，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。采用RTCA實時監測，以CI作為細胞增殖情況。CI=(Rn-Rb)/15，其中Rn表示孔接種有細胞時的電極阻抗值，Rb表示孔中只有培養基時的背景阻抗值。根據曲線分析小檗堿、人參皂苷Rg3藥效隨濃度及時間變化的特征，并用儀器自帶的軟件計算出合適時間點的半數抑制率濃度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)。

采用聯合作用指數(combined index，CI) 分析小檗堿和人參皂苷Rg3對鼻咽癌細胞增殖是否有協同抑制效應。選出協同抑制效應最強的聯合用藥濃度用于后期實驗，小檗堿和人參皂苷Rg3單用的濃度均同聯合使用時的濃度。

2.4 細胞凋亡檢測實驗分組：將細胞分成5組：①溶劑對照組：0.1%DMSO；②小檗堿組：10 μmol·L-1Ber；③人參皂苷Rg3組：5 μmol·L-1Rg3；④小檗堿+人參皂苷Rg3組：10 μmol·L-1Ber+5 μmol·L-1Rg3；⑤陽性對照組：15 μmol·L-1順鉑。

2.4.1Hoechst 33342染色法觀察細胞凋亡形態 取對數生長期CNE2細胞，消化重懸為單個細胞，按1×105個細胞/孔接種到6孔板中，培養12 h后，根據實驗分組加入不同濃度的藥物分別干預CNE2細胞48 h，用PBS漂洗2次，每孔加入1mL 10 mg·L-1的Hoechst 33342染色液，于培養箱中避光染色20 min，吸盡Hoechst 33342染色液，再用PBS漂洗3次，于熒光倒置顯微鏡下觀察CNE2細胞核形態和染色情況，拍照，重復3次。

2.4.2流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數生長期CNE2細胞，消化重懸為單個細胞，按3×105個細胞/皿接種到60 mm培養皿中，培養12 h后，根據實驗分組加入不同濃度的藥物分別培養48 h，用胰酶(不含EDTA)消化重懸，800 r·min-1離心3 min，棄上清，用1 mL PBS漂洗3次，用1×Binding buffer重懸細胞，調整細胞密度為2×1010個·L-1。將100 μL各組細胞分別移入EP管，加入5 μL FITC和5 μL PI，混勻后避光染色15 min，加入100 μL 1×Binding buffer終止染色，30 min內從各EP管中取20 μL染色液上機檢測細胞凋亡，并用FCS Express 6 Flow Research Edition軟件分析各組細胞凋亡情況。實驗重復3次。

2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達CNE2細胞經不同組藥物處理36 h后，加入含1%PMSF的RIPA裂解液處理15 min，4 ℃條件下1 000×g離心 5min后取上清，BAC法測定蛋白濃度。每組取30 μg總蛋白，10% SDS-PAGE分離蛋白，運用電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜。含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h后加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后孵育二抗1 h，洗膜后放入Odyssey熒光成像儀中，顯影，并分析各蛋白條帶的相對灰度值。

3 結果

3.1 小檗堿聯合人參皂苷Rg3對CNE2細胞增殖的影響RTCA結果顯示，小檗堿、人參皂苷Rg3的增殖曲線皆低于溶劑對照組(Control)，表明兩藥單用能夠抑制CNE2細胞增殖，且抑制效果與藥物濃度的增加相關(Fig 1)。小檗堿24 h、48 h、72 h IC50值分別為(31.06±0.27)、(21.71±0.58)、(17.50±0.35) μmol·L-1，人參皂苷Rg3 24 h、48 h、72 h IC50值分別為(36.62±0.37)、(26.82±0.43)、(21.87±1.10) μmol·L-1。其中，20 μmol·L-1小檗堿在不同時間點對CNE2細胞的抑制率分別為(42.12±0.30) %(24 h)、(48.63±0.64) %(48 h)和(52.9±0.32) %(72 h)，均接近50%，因此在后續實驗中我們將20 μmol·L-1視為小檗堿的IC50值。

將2.5 μmol·L-1(0.125 IC50)、5 μmol·L-1(0.25 IC50)、10 μmol·L-1(0.5 IC50)、20 μmol·L-1(IC50)、40 μmol·L-1(2 IC50)濃度的小檗堿和對應不同濃度的人參皂苷Rg3聯合作用于CNE2細胞，RTCA顯示不同濃度小檗堿和人參皂苷Rg3聯用后，藥物均可以抑制CNE2細胞的增殖(Fig 2)。

利用CompuSyn 軟件計算不同濃度組合下兩藥聯用的CI值，發現10 μmol·L-1的小檗堿與5 μmol·L-1Rg3 聯用時CI值為0.663±0.022，CI<1，具有較好的協同效應，故后期選擇該濃度組合進行研究。

Fig 1 Inhibition of berberine or ginsenoside Rg3 on proliferation of CNE2 cells by RTCA

Fig 2 Inhibition of different concentrations of berberine combined with ginsenoside Rg3 on proliferation of CNE2 cells

為了進一步研究小檗堿和人參皂苷Rg3聯合用藥的效應，我們采用10 μmol·L-1的小檗堿與5 μmol·L-1Rg3進行聯合用藥研究。RTCA顯示，10 μmol·L-1小檗堿與5 μmol·L-1人參皂苷Rg3聯合處理CNE2及6-10B細胞后對細胞增殖的抑制作用均明顯強于同濃度單藥組(Fig 3)。

3.2 小檗堿聯合人參皂苷Rg3對CNE2細胞凋亡的影響

3.2.1Hoechst 33342染色觀察細胞形態 Hoechst 33342染色結果顯示：溶劑對照組細胞的細胞核完整，呈均勻一致的淡藍色微弱藍光。小檗堿和人參皂苷Rg3單獨處理后的細胞出現凋亡特征，即部分細胞核呈顆粒狀亮藍色，同時伴有細胞核的邊集、碎裂、皺縮等，且隨作用時間的延長，凋亡特征越明顯。而小檗堿與人參皂苷Rg3聯合用藥組大量細胞出現染色熒光加強、核染色質濃縮等典型細胞凋亡現象，且凋亡特征較兩單藥組更明顯(Fig 4)。

3.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡 48 h后小檗堿組凋亡率為(48.29±0.76)%，其中早凋細胞占(44.62±0.67)%。人參皂苷Rg3組凋亡率為(31.57± 1.21)%，其中早凋細胞占(25.87±0.95)%。而小檗堿聯合人參皂苷Rg3組凋亡率明顯上升，為(68.24±1.10)%，分別是小檗堿組和人參皂苷Rg3組的1.41倍和2.16倍，其中早凋(56.24±0.76)%。順鉑組凋亡率為(70.41± 1.49)%，其中早凋細胞占(62.57±1.35)%(Fig 5)。

以上結果表明，小檗堿和人參皂苷Rg3聯合用藥誘導鼻咽癌CNE2細胞凋亡的作用比單獨使用小檗堿或人參皂苷Rg3時更強，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

3.3 小檗堿聯合人參皂苷Rg3對鼻咽癌CNE2細胞PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白表達的影響Western blot結果顯示，各藥物組細胞總Akt的表達量與溶劑對照組相比沒有明顯變化，但PI3K p110α和Thr308 磷酸化的Akt(p-Akt)在小檗堿聯合人參皂苷Rg3組細胞中的表達明顯低于其它3個組細胞(P<0.05)(Fig 6)。這提示小檗堿聯合人參皂苷Rg3可能通過作用于PI3K/Akt信號通路來抑制體外CNE2細胞的增殖，誘導細胞凋亡。

3.4 PI3K/Akt信號通路在小檗堿聯合人參皂苷Rg3抑制CNE2細胞增殖及誘導凋亡中的調控作用為進一步研究 PI3K/Akt信號通路是否在小檗堿聯合人參皂苷Rg3抑制CNE2細胞增殖、誘導細胞凋亡中發揮關鍵作用，將細胞分為：溶劑對照組(Control)、小檗堿(10μmol·L-1)+人參皂苷Rg3(5μmol·L-1)組 ，PI3K/Akt信號通路的激活劑(SC79：12.5μmol·L-1)組、SC79+小檗堿 +人參皂苷Rg3組、PI3K/Akt信號通路的抑制劑(LY294002：50μmol·L-1)組。Westernblot結果顯示，與溶劑對照組相比，小檗堿+人參皂苷Rg3組、LY294002組、SC79+小檗堿+人參皂苷Rg3組p-Akt的表達均下降(P<0.05)；且較小檗堿+人參皂苷Rg3組，p-Akt在SC79+小檗堿+人參皂苷Rg3組細胞中的表達量相對上升(P<0.05)；而Akt總蛋白表達量在各組間差異無顯著性(Fig7)。流式結果顯示，細胞凋亡率由高到低為：LY294002組、小檗堿+人參皂苷Rg3組、SC79+小檗堿+人參皂苷Rg3組、Control組、SC79組(Fig8)。RTCA結果顯示，各組細胞增殖能力與凋亡情況相反(Fig9)。Westernblot進一步檢測發現：小檗堿+人參皂苷Rg3組、LY294002組及SC79+小檗堿+人參皂苷Rg3組中Bax表達較溶劑對照組皆增高，而Bcl-2、Survivin和PCNA表達量下降(P<0.05)。SC79+小檗堿+人參皂苷Rg3組中Bax的表達較小檗堿與人參皂苷Rg3聯合組相對下調；而Bcl-2、Survivin及PCNA表達量升高(P<0.05)(Fig10)。即PI3K/Akt信號通路激活后，小檗堿聯合人參皂苷Rg3抑制CNE2細胞增殖和誘導細胞凋亡的效應降低，抗凋亡蛋白和增殖相關蛋白表達量增加，凋亡相關蛋白表達下降。

Fig 3 Inhibition of berberine and ginsenoside Rg3 on proliferation of NPC cells A： CNE2 cells； B： 6-10B cells.

Fig 4 Effect of berberine and ginsenoside Rg3 on apoptosis morphology of CNE2 cells (bar=100 μm, 200×)

Fig 5 Effect of berberine and ginsenoside Rg3 on apoptosis rate of CNE2 cells n=3)

Fig 6 Effect of berberine combined with ginsenoside Rg3 on expression of key proteins in PI3K/Akt pathway in CNE2 cells n=3)

Fig 7 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on expression of key proteins in pathway n=3)

Fig 8 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on berberine combined with ginsenoside Rg3 induced apoptosis n=3) *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs Ber+Rg3 group

Fig 9 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on berberine combined with ginsenoside Rg3 inhibition of cell proliferation by RTCA

4 討論

NPC是一種最常見的鱗狀上皮細胞癌，高發于東南亞和北非地區，尤其是我國南方各省[9]。最新世界腫瘤統計數據顯示，2018年全球NPC新增病例約129 079例，死亡72 987例，其中超過45%的新病例位于我國，且發病率呈逐年增加趨勢，嚴重威脅了人民的身體健康[10]。放療與化療是目前比較有效的治療NPC的方法，但晚期高分化患者對放療敏感度較差，預后效果不佳，容易復發甚至轉移。而常規化療藥物毒副作用大、單一藥物易產生耐藥性，使得鼻咽癌患者的療效和生活質量明顯下降[11]。因此，尋求一種更加安全高效的治療方法和藥物是鼻咽癌臨床治療過程中迫切需要解決的問題。中醫藥在治療腫瘤時具有藥源豐富、組方靈活、毒副作用小、安全性高等優勢，且中藥可作用于多途徑、多靶點，從而產生更加有效和持久的治療效果。因此，從傳統中藥中尋找抗腫瘤的活性成分，將其組合發揮藥物的協同作用，進而研究其作用機制，已成為當前抗腫瘤藥物的研究熱點之一。

Fig 10 Effect of PI3K/Akt signaling pathway activator and inhibitor on berberine combined with ginsenoside Rg3 of related proteins expression n=3)

“氣虛染毒”是NPC的中醫病因病機，益氣解毒是其治療原則之一[2-3]。黃連性寒味苦，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效；人參性溫、平，味甘、微苦，歸脾、肺經、心經，乃“滋補養生、扶正固本”之極品；兩者聯用具有益氣解毒之效，是中醫臨床上治療腫瘤的方劑中使用頻次較高的中藥。近年來發現黃連的主要活性成分小檗堿能通過抑制SP1、EMT的表達提高鼻咽癌放療敏感性[12]；通過EB病毒核抗原1依賴性機制和抑制腫瘤相關成纖維誘導的STAT3的活化來抑制鼻咽癌細胞的增殖和成瘤能力[13-14]。人參的活性成分人參皂苷Rg3可增強鼻咽癌放療患者外周血淋巴細胞免疫功能，減輕放療毒副作用,還可通過抑制EMT抑制鼻咽癌細胞的侵襲和遷移[15-16]。這些提示小檗堿與人參皂苷Rg3可作為治療NPC的潛在藥物，但關于兩者聯用效果是否更佳的研究相對較少。我們前期研究發現小檗堿聯合人參皂苷Rg3可能通過MAPK/ERK信號通路發揮協同抗鼻咽癌的作用[7]，而相對于以單一的信號通路為靶點，藥物同時作用于2條或2條以上的通路抗腫瘤效果更佳。小檗堿與人參皂苷Rg3的協同作用是否還涉及其他的信號通路仍需進一步探究。

PI3K/Akt信號通路在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和自噬中具有重要的調控作用[8]。前期文獻報道小檗堿和人參皂苷Rg3單用均能下調PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白的表達[6,17]。因此，我們推測小檗堿聯合人參皂苷Rg3可能通過抑制PI3K/Akt信號通路、調控凋亡相關蛋白的表達，最終達到協同抗鼻咽癌的作用。本研究中我們發現：與單獨用藥組相比，聯合用藥組細胞的PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白PI3K p110α和p-Akt的表達明顯下調(P<0.05)。提示小檗堿聯合人參皂苷Rg3能夠抑制PI3K/Akt信號通路的活化。進一步研究發現PI3K/Akt信號通路激活后(p-Akt表達上升)，小檗堿聯合人參皂苷Rg3抑制CNE2細胞增殖和誘導細胞凋亡的效應降低，Survivin、PCNA及Bcl-2表達量增加，Bax的表達下降。說明PI3K/Akt信號通路的激活劑可減弱小檗堿聯合人參皂苷Rg3抑制鼻咽癌細胞增殖和促進細胞凋亡的作用，進一步證實了小檗堿與人參皂苷Rg3聯用后還可通過下調PI3K/Akt通路關鍵蛋白p-Akt的表達，影響增殖、凋亡相關蛋白的表達，從而抑制CNE2細胞增殖、誘導細胞凋亡。

綜上所述，本實驗我們證實了小檗堿與人參皂苷Rg3的協同作用，并且發現其可通過下調PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白PI3K110α、p-Akt的表達，從而促進Bax的表達、抑制Survivin、PCNA和Bcl-2的表達，最終誘導鼻咽癌CNE2細胞凋亡，抑制細胞增殖。后期實驗中我們將進一步驗證PI3K/AKT和MAPK/ERK 兩條信號通路是否在藥物協同抗鼻咽癌過程中存在交互作用。這些研究有助于我們闡明小檗堿聯合人參皂苷Rg3治療鼻咽癌的分子機制，可為其治療鼻咽癌的臨床應用提供實驗依據，也可為益氣解毒類中藥治療鼻咽癌的現代開發應用提供新方向。