Box-Behnken設計-響應面法優化山茱萸葉總三萜提取工藝

朱登輝 張靖柯 李孟 石靜亞 劉娟娟 魏俊俊 鄭曉珂 馮衛生

摘 要 目的：優化山茱萸葉總三萜提取工藝。方法：在山茱萸葉充分溶脹的基礎上，采用加熱回流法提取其總三萜。在單因素試驗中考察乙醇體積分數、液料比、提取時間和提取次數對山茱萸葉總三萜含量的影響;以齊墩果酸為對照品，采用紫外-可見分光光度法測定總三萜含量。在單因素試驗的基礎上，固定提取次數為3次，以總三萜含量為響應值，以乙醇體積分數、液料比、提取時間為響應因素，采用Box-Behnken設計-響應面法優化山茱萸葉總三萜的提取工藝并進行驗證。結果：山茱萸葉總三萜的最佳提取工藝為乙醇體積分數73%、液料比38 ∶ 1（mL/g）、提取時間60 min。3次驗證試驗結果顯示，山茱萸葉總三萜的含量分別為6.92%、6.91%、6.84%，平均含量為6.89%（RSD=0.63%），與預測值（7.28%）的相對誤差為5.36%。結論：優化的提取工藝穩定、可靠，可用于山茱萸葉總三萜的提取。

關鍵詞 山茱萸葉;總三萜;Box-Behnken設計;響應面法;提取工藝

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To optimize the extraction technology for total triterpenes from the leaves of Cornus officinalis. METHODS： Based on the full swelling of the leaves of C. officinalis， total triterpenes was extracted with heating reflux method. The effects of ethanol concentration， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on the contents of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were investigated by single factor test. Using oleanolic acid as control， the contents of total triterpenes were detected by UV spectrometry. On the basis of single factor test， fixing the times of extraction as 3 times， taking the contents of ?total triterpenes as response value， using ethanol volume fraction， solid-liquid ratio and extraction time as factors， Box-Behnken design-response methodology was used to optimize the extraction technology of total triterpenes from the leaves of C. officinalis， and the optimized extraction technology was validated. RESULTS： The optimal extraction technology of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were as follows as ethanol concentration of 73%， liquid-to-material ratio of 38 ∶ 1 （mL/g）， extraction time of 60 min. Results of 3 validation tests showed that the contents of total triterpenes from the leaves of C. officinalis were 6.92%， 6.91%， 6.84%; the average content was 6.89% （RSD=0.63%）， relative error of which with the predicted value （7.28%） was 5.36%. CONCLUSIONS： The optimized technology is stable and reliable， and can be used for the extraction of total triterpenes from leaves of C. officinalis.

KEYWORDS ? Leaves of Cornus officinalis;Total triterpenes;Box-Behnken design; Response surface methodology; Extraction process

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，具有補益肝腎、收澀固脫的功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛等癥[1]。該藥主要分布于我國河南、浙江、湖南等地[2]。近年來，研究人員發現，山茱萸葉也有藥用價值，有文獻報道山茱萸葉具有細胞毒活性和抗氧化活性[3-5]。但是作為非傳統藥用部位的山茱萸葉在山茱萸果實采收過程中多作為廢棄物處理，造成了藥用資源的浪費。

本課題組在前期研究中發現，山茱萸葉中含有大量三萜類化合物，而三萜類化合物已知的生物活性有保肝、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎、調節免疫、利尿、抗病毒等[6-13]。鑒于此，為擴大山茱萸的藥用資源并對山茱萸葉進行開發，本研究以干燥的山茱萸葉為原料，采用Box-Behnken試驗設計方案，通過響應面法對山茱萸葉總三萜的提取工藝進行優化，并對影響山茱萸葉總三萜含量的主要因素進行分析，為該藥材資源的后續研究和開發利用奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Evolution 300型紫外-可見分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];OSB-2200型旋轉蒸發儀（日本EYELA株式會社）;BT 25S型電子分析天平（d=0.01 mg，德國Sartorius公司）;XMTD-6000型三用電熱恒溫水箱（北京市長風儀器儀表公司）。

1.2 藥品與試劑

山茱萸全葉采自河南省南陽市西峽縣山茱萸GAP種植基地，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為真品，曬干后于陰涼干燥處保存，備用;齊墩果酸對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-12041606，純度：≥98%）;95%醫用乙醇（衛輝市眾誠消毒制劑有限公司）;香草醛（分析純，天津市光復精細化工研究所）;冰醋酸（分析純，天津大茂化學試劑廠）;高氯酸（分析純，天津政成化學制品有限公司）;甲醇（色譜純，天津四友精細化學品有限公司）;乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細化工有限公司）;水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 總三萜含量測定方法的確定

根據2020年版《中國藥典》（一部）中三萜含量測定的方法與對照品的選擇[1]，并結合相關文獻[14]，確定本研究以齊墩果酸為對照品，采用紫外-可見分光光度法在546 nm波長處測定山茱萸葉中總三萜的含量。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品20.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到質量濃度為800.00 μg/mL的齊墩果酸對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取山茱萸葉，粉碎，稱取粗粉5.00 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇200 mL，靜置10 min使其充分溶脹。待溶脹完全后，將圓底燒瓶置于500 mL加熱套中，加熱至沸騰，加熱回流提取30 min。提取完畢后將提取液靜置、冷卻、過濾除雜。濾液以水浴濃縮干燥并用70%乙醇分散后轉移至50 mL量瓶中，定容，得到供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的繪制 分別吸取齊墩果酸對照品貯備液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL至25 mL量瓶中，以空氣泵吹干，放冷;精密加入5.0%香草醛-冰醋酸溶液（現用現配）0.80 mL、高氯酸3.20 mL，搖勻，70 ℃水浴加熱15 min后再于冰水浴中靜置5 min;取出，精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻，得到質量濃度分別為4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 μg/mL的系列齊墩果酸對照品溶液。以相應試劑為空白，照2020年版《中國藥典》（四部）通則0401紫外-可見分光光度法[15]，在546 nm波長處測定各對照品溶液的吸光度。以齊墩果酸的質量濃度（y，μg/mL）為縱坐標、吸光度（x）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為y=0.020 3x+0.000 1（R2=0.999 7）。結果表明，齊墩果酸的質量濃度在4.00～24.00 μg/mL內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品貯備液0.50 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.3.1”項下方法操作，在546 nm波長處連續測定6次吸光度。結果，吸光度的RSD=0.08%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下同一供試品溶液0.10 mL，按“2.3.1”項下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，室溫條件下分別于顯色后0、30、60、90、120、150 min時，在546 nm波長處測定吸光度。結果，吸光度的RSD=0.96%（n=6），表明供試品溶液在制備后室溫放置150 min內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取山茱萸葉粗粉5.0 g，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，顯色后立即在546 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線法計算總三萜含量。結果，含量的RSD=0.66%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密吸取“2.3.4”項下制備的供試品溶液（總三萜質量濃度分別為1 407.34、1 412.72、 ? ?1 414.64、1 420.88、1 422.34、1 427.76 μg/mL）各0.10 mL，分置于6個25 mL量瓶中，分別加入對照品貯備液各0.20 mL，按“2.3.1”項下方法操作，測定并計算加樣回收率。結果，平均加樣回收率為98.8%，RSD=0.69%（n=6），表明該方法準確度良好。

2.4 山茱萸葉總三萜含量的測定

精密吸取供試品溶液0.20 mL至25 mL量瓶中，按“2.3.1”項下方法“以空氣泵吹干……精密加入乙酸乙酯16.00 mL，搖勻”步驟操作，作為待測樣品溶液。以相應試劑為空白，在546 nm波長處測定待測樣品溶液的吸光度，并根據標準曲線法計算山茱萸葉總三萜的含量。

2.5 單因素試驗初步篩選總三萜提取工藝

結合文獻方法[16-18]初步篩選影響總三萜含量的因素，發現乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取次數等4個因素對總三萜含量影響較大，故以總三萜含量為指標，以乙醇體積分數（30%、50%、70%、90%）、液料比[10 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1（mL/g）]、提取時間（30、60、90、120 min）、提取次數（1、2、3、4次）為因素，在固定其余3個因素的條件下進行單因素試驗，以確定各因素的優化區間，詳見圖1。

2.5.1 乙醇體積分數的影響 從圖1A可以看出，隨著乙醇體積分數的增加，山茱萸葉總三萜含量先上升后下降，在乙醇體積分數達到70%時，山茱萸葉總三萜含量達到最高。筆者推測這是因為游離三萜類化合物極性小，可溶于乙醇;而三萜皂苷類化合物極性較大，易溶于熱水、乙醇等。因此，當提取溶劑中含水量較大時，總三萜在提取溶劑中的溶解度受限而不能被充分提取，導致其含量降低;當提取溶劑中含水量較小時，雖因乙醇體積分數的增大而使總三萜的溶解度有所增加，但乙醇體積分數過大又可能會導致山茱萸葉的溶脹度降低，反而使總三萜含量降低[19]。

2.5.2 液料比的影響 從圖1B可以看出，隨著液料比的增加，山茱萸葉總三萜含量一直呈現上升趨勢，但當液料比達到30 ∶ 1（mL/g）時這一上升趨勢趨于平緩。筆者推測這是因為隨著提取溶劑用量的增加，山茱萸葉的溶脹度也會隨之增大，其中的總三萜會越來越多地進入提取溶劑，最終達到平衡;另外在總三萜溶解度不變的情況下，提取溶劑用量的增加也會使總三萜的提取總量有所增加，但是當總三萜含量達到一定程度后，藥材中的總三萜已基本提取完全，再增加液料比也難以使其含量有較大的改變。

2.5.3 提取時間的影響 從圖1C可以看出，隨著提取時間的增加，山茱萸葉總三萜含量一直呈現上升趨勢，但當提取時間達到90 min時這一上升趨勢趨于平緩。筆者推測這是因為剛開始提取時，山茱萸葉可能未能夠充分地溶脹，總三萜的溶出度較低;隨著提取時間的增加，山茱萸葉的溶脹度逐漸增大，總三萜大量溶出;但當提取時間達到90 min左右時，藥材中的總三萜已基本提取完全，其含量增加趨于平緩。

2.5.4 提取次數的影響 從圖1D可以看出，隨著提取次數的增加，山茱萸葉總三萜含量呈現上升趨勢，但當提取次數超過3次時這一上升趨勢趨于平緩。筆者推測這是因為剛開始提取時，提取溶劑能夠和山茱萸葉充分地接觸，故總三萜含量逐漸升高;但當提取次數增加到一定程度時，藥材中的總三萜已基本提取完全，再增加提取次數也難以使總三萜含量有較大改變。

2.6 Box-Behnken設計-響應面法優化總三萜提取工藝

由單因素試驗結果可以看出，山茱萸葉總三萜含量隨提取次數的增加而增加，但是當提取次數達到3次時，總三萜含量隨提取次數上升的幅度明顯減小，此時再增加提取次數對總三萜含量的影響較小。同時，綜合考慮山茱萸葉總三萜提取成本等實際生產問題，將提取次數固定為3次，并以總三萜含量（Y）為響應值，以乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取時間（C）等3個影響因素為響應因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平的響應面試驗以優化山茱萸葉總三萜的最佳提取工藝。因素與水平見表1;Box-Behnken設計及結果見表2;方差分析結果見表3。

利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行回歸擬合分析，得到山茱萸葉總三萜含量（Y）對乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取時間（C）的三元二次回歸方程：Y=7.01+0.55A+0.16B+1.250×10-3C-0.037AB+0.13AC-0.043BC-1.45A2-0.13B2+ 0.16C2。從表3可以看出，失擬項P=0.105 1，說明殘差主要由隨機誤差組成，對優化試驗結果影響不顯著;交互項AB、AC、BC的P值均大于0.05，說明其交互作用較弱;A和A2的P值均小于0.01，說明A因素對總三萜含量的影響很顯著;B的P<0.05，說明B因素對總三萜含量的影響顯著;C的P>0.1，說明C因素對總三萜含量的影響不顯著，對于響應值Y的波動起次要作用。因此，因素A、B、C對山茱萸葉總三萜含量的影響主次順序為：A>B>C，即乙醇體積分數>液料比>提取時間。

在其他因素不變的情況下，選取2個交互因素對山茱萸葉總三萜含量進行響應面分析，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應面圖和等高線圖（詳見圖2）。結果發現，乙醇體積分數與液料比的交互作用顯著，即這2個因素的交互作用對山茱萸葉總三萜含量的影響顯著;此外，乙醇體積分數與提取時間的交互作用較顯著，液料比與提取時間的交互作用不顯著。

由圖2A可知，固定液料比時，隨乙醇體積分數的升高，總三萜含量先升高后降低，在乙醇體積分數達到70%～74%時其含量達到最大值;固定乙醇體積分數時，隨液料比的增大，總三萜含量變化不明顯。同時，等高線沿B軸變化相對密集，明顯密于A軸方向，表明乙醇體積分數對響應值峰值的影響比液料比大。由圖2B可知，液料比與提取次數的交互作用不顯著。固定液料比時，隨提取時間的變化，總三萜含量沒有明顯改變;固定提取時間時，隨液料比的增加，總三萜含量也沒有發生明顯的變化。從圖2C可知，固定提取時間時，隨乙醇體積分數的升高，總三萜含量先升高后降低，并在乙醇體積分數達到66%～74%時其含量達到最大值;固定乙醇體積分數時，隨提取時間的增加，總三萜含量并未發生明顯改變。

綜合圖2結果可知，乙醇體積分數對總三萜含量的影響較為顯著，提取次數和液料比對總三萜含量的影響不顯著。這與單因素試驗結論不符。究其原因，這可能與一開始將提取次數定為3次有關。當提取次數達到一定程度時，山茱萸葉中的總三萜基本溶出完畢，這時無論是增大液料比或者是延長提取時間，所能夠提取出的總三萜基本已達到峰值，所以才導致液料比與提取時間的交互作用不顯著;而乙醇體積分數對山茱萸葉溶脹度的影響較大，可在一定程度上消減提取次數帶來的負面影響，使得乙醇體積分數對總三萜含量仍有較為顯著的影響。

2.7 最優提取工藝的確定與驗證

利用Design Expert 8.0.6軟件進行計算，得出山茱萸葉總三萜的最佳提取工藝為：乙醇體積分數72.67%，液料比38.04 ∶ 1（mL/g），提取時間60 min;預測總三萜含量為7.28%。

結合生產實際，將該工藝簡化為：乙醇體積分數73%，液料比38 ∶ 1（mL/g），提取時間60 min。取5.00 g山茱萸葉粗粉，按照該工藝條件進行提取，平行操作3次。結果，總三萜含量分別為6.92%、6.91%、6.84%，平均含量為6.89%（RSD=0.63%），與預測值的相對誤差為5.36%。

3 討論

近年來，一直有學者進行中藥非傳統入藥部位的開發及藥用部位的擴大研究，如杜仲葉可以在某些方面代替杜仲（樹皮）進行使用[20]。山茱萸葉作為山茱萸的非傳統藥用部位，雖然表現出了一定的生物活性，但是少有學者對其進行研究，對山茱萸葉總三萜的研究更是鮮見。因此，筆者選用果實成熟期的山茱萸葉進行研究，旨在擴大山茱萸的入藥部位，為后續山茱萸的開發奠定基礎;同時，選取果實成熟期的山茱萸葉進行研究，可以與山茱萸干燥成熟果實中的總三萜含量作比較，為后續研究提供參考。

響應面法是一種綜合設計試驗和數學建模的優化方法，具有試驗次數少、精度高、預測值精準的優點，已廣泛應用于中藥工藝領域[21-22]。本研究在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計-響應面法優化山茱萸葉總三萜的提取工藝，以期得到一種高效的提取方法。研究結果表明，乙醇體積分數對山茱萸葉總三萜含量具有顯著影響，當乙醇體積分數達到70%左右時，山茱萸葉總三萜含量達到最大值。這一方面是因為水可以增加山茱萸葉的溶脹度，另一方面是因為乙醇對已溶脹的山茱萸葉中的游離三萜和三萜皂苷均有良好的溶解性，但是醇類溶劑又會降低山茱萸葉的溶脹度。綜合可得，70%的含水乙醇可最大程度地將山茱萸葉總三萜提取出來。

本研究也有不足之處，如將提取次數固定為3次雖然能夠最大程度地提取出山茱萸葉中的總三萜，但這也使得在改變液料比或提取時間進行試驗時，提取液中的總三萜含量都較為接近山茱萸葉所含總三萜總量，從而導致液料比或提取時間對總三萜含量的影響均不顯著。而乙醇體積分數對山茱萸葉溶脹度的影響較大，因而其對總三萜含量仍有較為顯著的影響。

綜上所述，本研究選用加熱回流提取法，在研究不同單因素條件對山茱萸葉總三萜含量影響的基礎上，采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計-響應面試驗，得到乙醇體積分數、液料比、提取時間與山茱萸葉總三萜含量的回歸模型，并對不同因素的交互作用與山茱萸葉總三萜含量的關系進行了響應面分析，得到各影響因素對山茱萸葉總三萜含量的影響大小為：乙醇體積分數>液料比>提取時間;所建立的回歸模型較為合理，能夠用于預測山茱萸葉總三萜的含量;驗證值與預測值的相對誤差在一個相對合理的范圍，說明該優化工藝較為穩定、可靠，可用于山茱萸葉總三萜的提取。

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（收稿日期：2020-06-29 修回日期：2020-09-11）

（編輯：胡曉霖）