不同滅活溫度對新型冠狀病毒核酸檢測的影響

嚴 謹，陳小鳳，熊金萍，蔣佳辰，夏鳳霞，何九宏

重慶市渝北區疾病預防控制中心微生物科，重慶 401120

在開展新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測的工作中，生物檢材有極強的傳染性，給實驗室操作人員帶來較大的生物安全隱患和心理壓力。冠狀病毒不耐高溫，嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒在56 ℃、30 min，70 ℃、15 min時已經失活[1]，這提示可以采取高溫方式滅活SARS-CoV-2來保護實驗操作人員的生物安全。SARS-CoV-2和SARS病毒同屬β屬冠狀病毒，理化性質具有參考性，但溫度過高可能會對核酸完整性產生破壞，降低PCR檢測效果，另外，考慮到溫度傳導速度，本研究選擇56 ℃、35 min和65 ℃、15 min兩組試驗條件。已有研究顯示，使用56 ℃、30 min處理咽拭子標本滅活病毒對后續SARS-CoV-2核酸檢測無明顯影響[2]，但由于標本量少且循環閾值(Ct值)較低，無法對Ct值較高的標本是否具有相同的一致性進行評價。因此本研究將探討不同Ct值標本，特別是Ct值較高的標本在不同滅活溫度處理后對檢測SARS-CoV-2核酸的結果是否存在影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本中心2020年1月25日至2月25日采集的SARS-CoV-2核酸檢測陽性標本14份。

1.2試劑與儀器 達安基因SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，批號：2020018)，達安基因核酸提取和純化試劑(DA0633)，達安Stream全自動核酸提取儀，Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7 Flex實時定量PCR儀，Eppendorf ThermoMixerTMC振蕩器。

1.3方法 實驗人員按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[3]進行實驗操作和生物安全防護。(1)各標本取病毒采樣液210 μL分裝到3個EP管中，做好標記，由于恒溫金屬浴溫度波動系數更小[4]，標本間不易污染，分別用Eppendorf ThermoMixerTMC振蕩器56 ℃、35 min，65 ℃、15 min滅活處理。(2)核酸提取和體系配制使用達安Stream全自動核酸提取儀以及配套提取試劑(DA0633)。(3)核酸擴增使用Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7 Flex 實時定量 PCR 儀，每批結果設陰陽性對照，在陰陽性對照結果正常的情況下，結果有效。每個測試設置3次復孔，取平均Ct值進行計算。

1.4統計學處理 采用GraphPad Prism 8軟件進行統計學分析，對SARS-CoV-2的開放讀碼框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白(N)基因在未滅活組和滅活組中的Ct值通過Anderson-Darling、D′Agostino-Pearson、omnibus、Shapiro-Wilk、Kolmogorou-Smirnou進行正態性檢驗，P>0.05符合正態分布。對不同溫度滅活的Ct值差異采用非參數檢驗的Mann-WhitneyU檢驗進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1未滅活處理及不同溫度滅活處理后標本的熒光定量PCR檢測結果 對標本進行熒光定量PCR檢測，并對檢測結果進行統計分析，見表1。對未滅活組和不同溫度滅活組的結果進行非參數檢驗Mann-WhitneyU分析，結果顯示，56 ℃、35 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值差異無統計學意義(U=95.50、95.00，P>0.05)，65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值的差異無統計學意義(U=94.00、94.50，P>0.05)，56 ℃、35 min和65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值的差異無統計學意義(U=96.00，P>0.05)。

表1 不同滅活溫度處理對ORF1ab和N基因Ct值的影響

2.2不同Ct值標本在不同滅活溫度處理下對SARS-CoV-2核酸檢測結果的影響 本研究選擇了Ct值≥34和Ct值<34的標本在未滅活和不同滅活溫度處理下的熒光定量PCR結果進行非參數檢驗Mann-WhitneyU分析。對于Ct值≥34的標本，結果顯示，56 ℃、35 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值的差異無統計學意義(U=31.50、31.00，P>0.05)，65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值的差異無統計學意義(U=14.00、15.00，P>0.05)，56 ℃、35 min和65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值差異無統計學意義(U=16.00，P>0.05)。

對于Ct值<34的標本在未滅活和不同滅活溫度方式下進行熒光定量PCR分析，結果顯示，56 ℃、35 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值差異無統計學意義(U=16.00、16.00，P>0.05)，65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值差異無統計學意義(U=24.00、23.00，P>0.05)，56℃、35 min和65℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值的差異無統計學意義(U=32.00，P>0.05)。

3 討 論

生物安全是開展病原微生物操作處理工作必須考慮的首要因素，在標本的采集以及核酸提取過程中要采取相應的防護措施或應在一定生物安全防護等級的實驗室進行。據研究發現，SARS-CoV-2可能的傳播方式是經飛沫傳播、接觸傳播以及呼吸道氣溶膠近距離傳播[5]，由于在相對密閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在氣溶膠傳播的可能，加大了實驗室操作人員感染的風險。為減少病毒的生物危害，研究者對高壓[6]、超聲波[7]、伽馬射線照射[8]、乙醇等方式處理標本進行探討，但這些方法需要額外的設備或試劑，且可能降低核酸檢測的敏感性，同時，各實驗室條件不盡相同，不易推廣。SARS-CoV-2是一種包膜脂質病毒，對溫度敏感，高溫處理標本簡單易行，對降低實驗室人員感染風險有重要意義，但由于高溫可能會使標本RNA降解，影響檢測結果準確性，目前，市面上SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒檢出限大都在500～1 000 copy/mL，陽性判讀Ct值在30～40[9]，對于灰區標本，由于接近試劑盒本身檢出限，樣品處理不當可能會造成檢測結果假陰性。本研究結果表明，56 ℃、35 min和65 ℃、15 min恒溫金屬浴滅活處理灰區標本對后續核酸檢測結果并無明顯影響，為后續SARS-CoV-2核酸檢測提供了不同的策略。分析原因，核酸降解的因素眾多，首先SARS-CoV-2是單鏈RNA病毒，不如雙鏈DNA穩定；其次，細胞的內源性RNA酶和外源性RNA酶較多，且活性強，高溫使RNA酶活性增強，不利于RNA病毒的提取和保存。然而，商品化核酸提取試劑的裂解液對RNA酶有充分的滅活作用[10]，降低了高溫對核酸降解的不利影響。雖然高溫對病毒滅活效果較好，但研究表明不同蛋白溶液和穩定劑對滅活效果存在影響[11]。因此，實驗室檢測人員在處理標本的過程中仍然應按照生物安全三級防護要求做好個人防護。