高鹽飲食激活腸JAK1/STAT3通路誘導腸上皮屏障功能障礙

李晨 李曉媚 劉亭 雷超 劉聰 劉志華

廣州醫科大學附屬第五醫院前沿醫學交叉研究中心，廣州市加速康復腹部外科重點實驗室，廣州醫科大學附屬第五醫院肛腸科（廣州510700）

高鹽被認為是高血壓和心血管疾病的最常見危險因素之一。有研究［1-3］表明，高鹽飲食可促進腸道炎癥性疾病的發生發展，已知高鹽飲食不但會影響腸道菌群組成，促進腸道炎癥因子的表達，還會加重小鼠結腸炎癥狀。研究［4］還發現長期的高鹽、高糖和高蛋白質飲食與炎癥性腸病（IBD）發病率增加具有顯著相關性［5-6］，高鹽或高脂飲食可能會破壞腸屏障，從而導致全身炎癥，腸屏障功能障礙是腸道疾病的重要特征，近期已有研究通過腦-腸軸將高鹽與腸道菌群聯系起來［7］，但高鹽飲食誘導腸功能損傷的機制尚未完全清楚。

Janus 激酶/信號轉導及轉錄激活因子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）通路是眾多細胞因子信號轉導的共同途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程［8-9］。實際上，由細胞因子引發的大多數免疫反應都依賴于STATs［10-11］。已有批準或正在研究抑制JAK/STAT 信號通路的抑制劑作用于IBD的治療［12-20］，JAK/STAT 抑制劑在IBD 的小鼠模型中顯示了與阻斷多種自身免疫途徑一致的強大療效［21］。高鹽飲食是否通過激活JAK/STAT 通路誘導腸屏障功能障礙的機制尚未明確，因此，本研究通過制備高鹽飲食小鼠模型，檢測各組結直腸組織的腸屏障蛋白和JAK/STAT 通路蛋白的改變，并進行相關性分析。此外，在細胞水平上，采用高濃度NaCl 對人正常結腸上皮細胞NCM-460 細胞進行處理，觀察高濃度NaCl 對腸細胞的腸屏障蛋白和JAK/STAT 通路蛋白的影響，進一步驗證高鹽是否能激活JAK/STAT 通路，并降低腸屏障緊密連接蛋白的表達，即引起腸屏障功能障礙。

1 材料與方法

1.1 主要試劑JAK1抑制劑Ruxolitinib，購于Sigma公司；兔抗ZO-1、β-actin 抗體購于艾博抗公司；鼠抗Occludin 抗體購于Proteintech 公司；兔抗JAK1、P-JAK1、STAT3、P-STAT3 抗體購于Cell Signaling TECHNOLOGY，CST 公司；DMEM 培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購于Gibco 公司；DMSO，戊巴比妥鈉，購于Sigma 公司；脫脂奶粉購于伊利公司；吐溫20購于天津科密歐化學試劑廠；無水乙醇購于廣州市番禺力強化工；BCA Protein Assay Kit、蛋白maker 購于Thermo Scientific；5×loading buffer、一抗稀釋液購于上海碧云天生物公司；細胞培養皿、離心管購于Corning 公司。

1.2 模型制備與分組

1.2.1 動物實驗體質量為（20 ± 5）g 的SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠購于廣東省實驗動物中心［合格證號為：SCXK（粵）2018-0002］；小鼠適應性喂養一周后，隨機分組，每組5 只，組別為正常飲食對照組（control）、高鹽飲食組（high salt diet，HSD），正常飲食對照組按照常規飼養方法，高鹽飲食組采用高鹽特制飼料（NaCl 成分為8%）飲食12 周。兩組小鼠予以自由飲食、飲水、予同等的光照時間，晝夜比12 h∶12 h，實驗終點未出現小鼠死亡，喂養12 周后小鼠分別予1.5 % 戊巴比妥鈉麻醉處死，開腹取出結腸組織，迅速收集所需數據，立即放入預先做好標記的凍存管中并放入液氮，再進行-80 ℃凍存。

1.2.2 細胞實驗采用人正常結腸上皮細胞NCM-460 細胞進行細胞實驗，設計組別：（1）正常對照組（control）；（2）高濃度NaCl組（high NaCl，50 mmol/L）；（3）高濃度NaCl+JAK1 抑制劑共孵育組high NaCl（50 mmol/L）+ Ruxolitinib（50 μmol/L），然后收集細胞進行后續實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白提取和樣品制備在收集好的結直腸組織，或處理過的腸細胞置于冰上，加入適量體積的含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解，結直腸組織在組織破碎儀的作用下制備成樣品勻漿液，4 ℃離心10 000 ×g，10 min。收集樣品上清液，然后取少量上清液，采用BCA Protein Assay Kit 檢測樣品的蛋白濃度，剩余上清液做后續實驗。

1.3.2 Western blot 實驗每個樣本取30 μg 蛋白，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃下搖晃過夜，加辣根過氧化酶（HRP）標記二抗，室溫孵育2 h，最后行ECL化學發光法顯色，用凝膠成像系統（chemiDoclM xRs+system，Bio-Rad）采集圖像，用Image-Pr0 Plus軟件進行灰度掃描。

1.3.3 口服糖耐量的測定先將兩組禁食12 h 后經尾靜脈采血測定空腹血糖值（blood glucose，BG），然后一次性灌胃給予40%葡萄糖溶液（2 g/kg），分別在灌胃后30、60、90 和120 min 檢測血糖值，繪制血糖-時間曲線，并采用梯形法計算曲線下面積（area under the curve，AUC），AUC（mmol/L·min）=1/2 ×（BG 0 min + BG 30 min）× 30 min + 1/2 ×（BG 30 min+BG 60 min）×30 min+1/2×（BG 60 min+BG 90 min）×30 min+1/2×（BG 90 min+BGl 20 min）×30 min。

1.4 統計學方法數據用（x±s）表示，采用SPSS 16.0 統計學軟件對數據進行分析處理，采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高鹽飲食對小鼠的體質量和腸道的代謝影響高鹽飲食12 周后，與正常飲食對照組相比，高鹽飲食組小鼠不僅體質量顯著降低（P＜0.05），結直腸的腸重量和腸長度也都顯著降低（表1）；此外，12 周的高鹽飲食還誘導了小鼠的糖耐受異常，在口服糖耐量試驗測得糖負荷60、90 和120 min 時間點的血糖濃度均顯著高于正常飲食對照組（P＜0.01，圖1 A），并且計算所得的血糖-時間曲線下面積（AUG）也明顯增加（P＜0.01，圖1 B），這些結果提示，高鹽飲食可誘導小鼠的體重和腸道等體內代謝異常。

表1 高鹽飲食小鼠模型的各項指標結果Tab.1 Results of various indicators in a mouse model of high-salt diet ± s

表1 高鹽飲食小鼠模型的各項指標結果Tab.1 Results of various indicators in a mouse model of high-salt diet ± s

注：control 組為正常飲食對照組，HSD 組為高鹽飲食組，*P ＜0.05 vs. 正常飲食對照組（control）

組別control 組HSD 組體質量（g）23.80 ± 0.90 18.90 ± 2.20*結直腸重量（g）0.196 3 ± 0.01 0.169 3 ± 0.01*結直腸長度（cm）8.10 ± 0.23 7.50 ± 0.21*

2.2 高鹽飲食對小鼠腸屏障功能的影響腸上皮屏障主要由細胞間的緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1 等）、下端粘附連接和細胞橋粒等形成的機械屏障，調控腸道通透性，使得跨細胞物質運輸保持動態平衡，所以緊密連接蛋白的表達量是衡量腸屏障功能的重要指標之一。通過Western blot 實驗檢測兩組小鼠腸組織中的緊密連接蛋白表達量，結果顯示，相對于正常飲食對照組，高鹽飲食組小鼠的結直腸組織的緊密鏈接蛋白ZO-1 和Occludin蛋白表達均明顯降低（P＜0.05，圖2），結果提示高鹽飲食可降低腸組織的緊密連接蛋白，影響小鼠腸屏障功能。

圖l 兩組小鼠口服糖耐量試驗結果Fig.1 Results of oral glucose tolerance test in two groups of mice

2.3 高鹽飲食對小鼠結直腸組織JAK1/STAT3 通路蛋白的影響本實驗檢測了兩組小鼠腸組織中的JAK1/STAT3 通路蛋白表達量，結果顯示，相對于正常飲食對照組，JAK1/STAT3 通路中的p-JAK1磷酸化蛋白明顯升高（P＜0.05），p-STAT3 磷酸化蛋白也具有明顯的增加趨勢（P＞0.05），結果表明高鹽飲食可激活腸組織JAK1/STAT3 通路。見圖3。

2.4 高濃度NaCl 對人正常結直腸上皮細胞JAK1/STAT3 通路的影響為了進一步驗證高鹽是否直接誘導了腸道JAK1/STAT3 通路激活，采用高濃度NaCl（50 mmol/L）孵育處理人正常結直腸上皮細胞NCM-460 細胞48 h，然后經過Western blot 實驗發現，與正常對照組相比，高濃度NaCl 可誘導p-JAK1磷酸化蛋白顯著升高（P＜0.05），p-STAT3 磷酸化蛋白表達顯著增多（P＜0.001），即JAK1/STAT3通路蛋白的磷酸化水平上升；但采用JAK1 抑制劑Ruxolitinib 共孵育48 h 后，該作用可被JAK1 抑制劑逆轉。這些結果表明，高濃度NaCl 可直接激活腸道JAK1/STAT3 通路。見圖4。

2.5 高濃度NaCl 對人正常結直腸上皮細胞腸屏障緊密連接蛋白的影響在高濃度NaCl 孵育處理人正常結直腸上皮細胞實驗中，與正常對照組相比，高濃度NaCl 除了可激活JAK1/STAT3 通路外，也顯著地降低了腸屏障緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 的表達（P＜0.05）；但是采用JAK1 抑制劑Ruxolitinib 與高濃度NaCl 共同孵育48 h 后，與高濃度NaCl 處理組相比，JAK1 抑制劑可使ZO-1和Occludin 的蛋白表達恢復至正常對照組的水平（P＜0.05）。綜上結果表明，高濃度NaCl 可通過激活JAK1/STAT3 通路誘導腸屏障蛋白表達受損。見圖5。

注：A，結直腸組織緊密連接蛋白電泳條帶；B，緊密連接蛋白ZO-1 的蛋白相對表達量；C，緊密連接蛋白Occludin 的蛋白相對表達量；control 組為正常飲食對照組，HSD 組為高鹽飲食組，*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs. 正常飲食對照組（control）

圖3 各組小鼠的結直腸組織JAK1/STAT3 通路蛋白Fig.3 JAK1/STAT3 pathway protein in colorectal tissue of each group of mice

圖4 高濃度NaCl 對人正常結直腸上皮細胞JAK1/STAT3 通路的影響Fig.4 The effect of high concentration NaCl on JAK1/STAT3 pathway in human normal colorectal epithelial cells

3 討論

當腸屏障緊密連接蛋白遭到破壞，腸上皮屏障功能障礙會導致腸通透性增加，隨后是有毒代謝物或管腔促炎分子的滲透，導致持續的炎癥和組織損傷，炎癥性腸病IBD 患者中表現出腸細胞旁通透性增。高鹽飲食誘導免疫細胞在腸道中積累，促炎性細胞因子增加，嚴重還可加劇神經炎癥［22］，并引起血管神經認知功能障礙［23-25］。作為人體重要防線的腸上皮屏障，具有防止腸內高負荷的細菌和毒素穿過腸粘膜進入人體血液循環的重要作用。因此，研究誘發腸屏障功能障礙的機制，可為社會提供針對腸道疾病的有效治療和預防方法。腸道作為食物吸收的重要器官，飲食習慣對腸道屏障功能的影響最大，而近年來也越來越多的研究發現高鹽飲食與慢性腸炎，腸易激等都密切相關。本研究發現連續12 周高鹽飲食明顯抑制腸道組織的屏障蛋白ZO-1 和Occludin的表達，并且降低結直腸的重量和長度，提示腸道功能受損。WILCK 等［26］也曾報道過中度高鹽飲食可導致人體高血壓，伴有腸菌紊亂和腸道過度免疫性損傷，并且高血壓患者血清中腸道脂肪酸結合蛋白（I-FABP）、連蛋白（腸道上皮緊密連接蛋白調節因子）以及脂多糖LPS 等都顯著升高，該結果是對本研究高鹽飲食誘導小鼠腸道屏障功能障礙的有力佐證，但其中的機制尚未明確。

圖5 高濃度NaCl 對人正常結直腸上皮細胞腸屏障緊密連接蛋白的影響Fig.5 The effect of high concentration of NaCl on tight junction protein of intestinal barrier of human normal colorectal epithelial cells

JAK/STAT 通路是近年來發現的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程。本研究除了發現高鹽飲食激活了小鼠腸組織JAK/STAT 通路和損傷腸屏障功能外；在腸上皮細胞實驗中也發現，高濃度NaCl 也顯著增加了JAK1 和STAT3 的磷酸化，并降低細胞的腸屏障蛋白表達，但是這些作用可被JAK 抑制劑阻斷，恢復腸細胞的屏障蛋白表達。DENG 等［27］在腦部星形膠質細胞實驗中也報道過相似結果，高鹽環境可刺激星形膠質細胞的STAT3 磷酸化增加，使用JAK 抑制劑則阻斷高鹽對STAT3 的磷酸化作用；LOPERENA等［28］也在具有高鹽飲食習慣的高血壓患者的主動脈內皮細胞中，發現STAT3、STAT5 磷酸化被激活；還有研究在大鼠腸道缺血再灌注損傷模型的研究中發現，腸組織的JAK/STAT 通路激活并伴有腸上皮細胞凋亡，使用右美托咪或小檗堿處理抑制JAK/STAT 通路活性后，可顯著減輕腸道缺血損傷及腸上皮細胞凋亡［29-31］。以上國內外研究結果從側面佐證了本研究提出“高鹽環境可能通過激活JAK1/STAT3 通路蛋白磷酸化誘導腸屏障功能障礙”的觀點。

綜上所述，本研究通過高鹽環境的動物模型和細胞模型，揭示了高鹽飲食損傷腸上皮屏障功能障礙的機制與JAK1/STAT3 通路激活密切相關，此外還發現JAK1 抑制劑具有治療高鹽誘導的腸上皮屏障功能障礙的作用，為治療腸道疾病提供新的輔助治療靶點、藥物和預防方法。