辛伐他汀聯合機械牽拉激活Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化

陳斌偉 劉圣曜 黃帥 王斌 陳元鴻

廣州醫科大學附屬第二醫院（廣州510260）

大段骨缺損和骨不連是骨科的棘手難題，不僅給患者帶來身體及心理傷害，也給其家庭及社會帶來沉重的經濟負擔。隨著醫學水平的發展及技術的不斷提高，牽張成骨成為臨床治療大段骨缺損和骨不連的常用方法［1-2］。然而，治療周期長及新骨生物力學性能差等缺點限制了牽張成骨在臨床廣泛應用［3］。如何加快新骨礦化速度、提高新骨生物力學強度及縮短治療周期是一個亟需解決的臨床難題。臨床上使用骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等促進成骨，但存在價格昂貴、半衰期短等缺點［4］。因此，探討促進牽張成骨的藥物具有重要的臨床及社會意義。

辛伐他汀（simvastatin，SIM）是一種常見的他汀類藥物，臨床上主要用于治療心腦血管疾病。近年來，體內外實驗研究發現辛伐他汀除降低血脂等作用外，尚可通過影響骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化影響發揮促成骨作用［5-6］，且與Wnt/β-catenin、BMP/Smads 等信號通路密切相關［7-8］。雖然辛伐他汀及適當機械刺激均能促進成骨，但兩者聯合應用是否能起到協同作用尚無報道，其相關機制研究更少。為此，本研究從體外探討辛伐他汀對機械牽拉環境下BMSCs 成骨分化的影響及Wnt/β-catenin信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料普通級80～100 g 雄性SD 大鼠（Sprague Dawley Rats）由南方醫科大學南方醫院動物實驗中心提供（許可證號：NFYY-2016-129），用于BMSCs分離培養等。低糖DMEM 培養基（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），胰蛋白酶（Amresco，美國），CCK-8（日本同仁公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs 培養大鼠頸椎脫臼處死后放入75%酒精浸泡5 min，生物安全柜內無菌條件分離出大鼠股骨和脛骨，將附著于骨上的肌肉盡可能剝離干凈后將骨依次浸泡于75%酒精和PBS（phosphate buffer saline）中各5 min，隨后將骨兩端干骺端剪斷暴露骨髓腔，10 mL 注射器吸取低糖DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's medium）培養液沖洗骨髓腔數次，沖出的骨髓裝于15 mL 離心管。將離心管以1 000 r/min 離心5 min，去掉上層培養基后加4 mL 含FBS（Fetal Bovine Serum）的低糖DMEM 培養基將底層沉淀物制成混懸液，將混懸液加入25 cm2的培養瓶中，第2 天細胞換液，以后每2～3 天換液1 次，細胞長至80%～90%時進行傳代，第3 代細胞使用成脂肪誘導液及成骨誘導液誘導14 d 及21 d 后行油紅O 及茜素紅染色，第3 ～4 代細胞用于后續實驗研究。

1.2.2 大鼠BMSCs 表面抗原分子的檢測第3 代BMSCs 長至80%～90%時將0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，將消化獲得的細胞放至15 mL 離心管以1 000 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀用PBS 重懸洗滌后，1 000 r/min 再次離心5 min，制成濃度為1 × 106/mL 單細胞懸液。1 × 105（100 μL）與5 μL熒光標記的單克隆抗體混合（抗大鼠CD45-PE、CD11b-FITC、CD79-FITC 和CD90-PE），并在暗室中孵育15 min。用PBS 洗滌細胞2 次后立即使用Coulter Elite-ESP 流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.3 實驗分組實驗分為對照組（CON）、辛伐他汀組（SIM）、機械牽拉組（STR）及SIM+STR 組。STR 組：第3 代BMSCs 細 胞以2.0 × 105/孔 接 種 于BioFlex 培養板中，將BioFlex 培養板置于FX-5000T細胞應力裝置進行牽拉，以10%機械牽拉以1 Hz 進行牽拉，每天牽拉6 h 連續牽拉7 d。對照組不予機械牽拉，STR+SIM 在機械牽拉的同時加10-7mol/L辛伐他汀，實驗中每2～3 天換液1 次。此外，添加20 nmol/L 的DKK1 觀察Wnt/β-catenin 通路在聯合應用中的作用。PCR、堿性磷酸酶（ALP）染色、Western blot 等方法檢測各組成骨分化的變化。

1.2.4 ALP 活性檢測各組細胞干預結束后按5×104/孔接種于12 孔板，成骨誘導液繼續培養3 d。吸去各孔中的培養液后用PBS 輕洗細胞3 次，4%多聚甲醛固定細胞15 min 后再次用PBS 洗2 次。每孔加入配好的ALP 染色液1.5 mL 常溫避光染色30 min；去掉染液后用PBS 沖洗2 次，在室溫下晾干后顯微鏡下觀察并拍照。ALP 活性檢：PBS 洗滌細胞2 次利后加入10 mmol/L 的Tris-HCL裂解細胞。收集細胞于4 ℃預冷的離心機上以10 000 g 的速度離心10 min，收集上清液行ALP 活性檢測。用0.1 mol/L 的NaOH 溶液中斷后在波長405 nm 處測其OD值，并于波長570 nm 處用BCA試劑盒測總體蛋白含量，ALP 活性用總蛋白進行對照。

1.2.5 基因的定量分析方法（RT-PCR）各組細胞干預結束后檢測成骨及β-catenin 相關基因，具體方法如下：提取細胞總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈，于20 μL 反應體系中加入引物、cDNA 模板和SYBR Green Master Mix。PCR 擴增反應條件：94 ℃預變性3 min；然后進行30 個循環反應，其溫度循環條件為：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；循環結束后72 ℃再延伸5 min。各基因引物序列如下：GAPDH：5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'（正義鏈），5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'（反義鏈）；RUNX2：5'-GGCCACTTACCACAGAGCTA-3'（正義鏈），5'-GAGGCGGTCAGAGAACAAAC-3'（反義鏈）；Collagen I（Col 1a）：5'-CATGTTCAGCTTTGTGGACC-3'（正義鏈），5'-TTAGGGACCCTTAGGCCATT-3'（反義鏈）；ALP：5'-AACAACCTGACTGACCCTTC-3'（正義鏈），5'-TCCACTAGCAAGAAGAAGCC-3'（反義鏈）；β-catenin：5'-TTGTACGAGCACATCAGGAC-3'（正義鏈），5'-GCACCCTTCAACTATCTCCTC-3'（反義鏈）；Osteocalcin（OCN）：5'-GACTGCATTCTGCCTCTCTG-3'（正義鏈），5'-ATTCACCACCTTACTGCCCT-3'（反義鏈）；LPR5：5'-CCTGGCGCTGTGACGGCTTCC-3'（正義鏈），5'-CAATGGCGCTGCTGTGGGCTGGTA-3'（反義鏈）。

1.2.6 Western blot 檢測各組干預結束后，去掉牽拉板中上清液，PBS 清洗2 次，加RAPI 裂解液后收集細胞加入15 mL 離心管中以2 000 r/min 離心20 min，收集上清按Bradford 法測定各組蛋白濃度。取25 μg 蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后用TBST洗3 次，再加入一抗anti-β-catenin 和anti-GAPDH單克隆抗體，將其置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日以TBST 洗3 次后加入HRP 標記的IgG 二抗室溫孵育30 min，用TBST 洗滌3 次后加入超敏發光底物，曝光顯影并用Image J 分析條帶灰度值。

1.3 統計學方法所有的統計均使用SPSS 19.0軟件進行分析。實驗數據均采用均數±標準差表示，單因素方差分析用于比較不同組別間的差異，兩組之間的差異用SNK-q檢驗進行分析。P＜0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs 性能及表面抗原分子的鑒定顯示第3 代細胞以長梭形為主（圖1A），BMSCs 經機械牽拉（圖1B）BMSCs 經成骨誘導液誘導21 d 后茜素紅染色顯示大量鈣結節形成（圖1C），BMSCs經成脂誘導液誘導14 d后油紅O染色示脂滴形成（圖1D），這些結果表明分離的細胞具有成骨及成脂分化能力，具有干細胞特性。流式細胞儀行細胞表面抗原分子鑒定結果示：CD79 和CD90 呈陽性表達，表達量分別為（96.9±1.2）%和（97.4±1.5）%，而CD11b和CD45呈陰性表達，表達量分別為（9.4 ± 0.8）%和（5.9±0.5）%（圖2），這些表面抗原表達符合BMSCs免疫表型。通過經典干細胞培養方法培養出大鼠BMSCs，為后面實驗順利進行奠定基礎。

2.2 機械牽拉聯合辛伐他汀促進大鼠BMSCs成骨分化ALP 活性結果顯示：與CON 組相比，SIM 組、STR 組以及STR+SIM 組均能不同程度促進大鼠BMSCs 的成骨分化，且STR + SIM 組對大鼠BMSCs的成骨分化作用最明顯（P＜0.05，圖3A）。

進一步檢測各組成骨基因表達，COL 1a 是骨形成的關鍵因子，主要由成骨細胞分泌。ALP 是成骨早期的標志物，其含量高低與成骨細胞分化密切相關。OCN 是成骨晚期基質礦化相關因子。RUNX2 是成骨分化過程的轉錄因子，直接反映成骨分化的程度。PCR 結果顯示SIM 組、STR 組以及STR+SIM 組成骨基因相對表達量較CON 組均上升，其中STR+SIM 組上升最明顯（P＜0.05），表明辛伐他汀、機械牽拉以及辛伐他汀聯合機械牽拉均能不同程度促進大鼠BMSCs 的成骨分化，對BMSCs 早期和晚期成骨分化均有促進作用，且辛伐他汀聯合機械牽拉對大鼠BMSCs 成骨分化作用最明顯（P＜0.05，圖3B）。

2.3 機械牽拉聯合辛伐他汀增加Wnt/β-catenin信號通路β-catenin 等基因表達PCR 及WB 結果顯示：與CON 組相比，SIM 組、STR 組以及STR+SIM組β-catenin 基因及蛋白表達含量均升高，且STR+SIM 組升高最明顯（P＜0.05，圖4），表明各組均能激活β-catenin 通路。

圖1 BMSCs 體外培養不同階段觀察結果Fig.1 Observation of BMSCscultured in vitro at different stage

圖2 第3 代BMSCs 表面抗原表達流式結果Fig.2 The immunophenotypic characterization of the third generation BMSCsanalyzed by Flow Cytometry

圖3 各組ALP 活性及成骨相關基因表達Fig.3 The ALP activity and the expression of osteogenesisrelated genes

2.4 抑制Wnt/β-catenin 通路降低機械牽拉聯合辛伐他汀促BMSCs 成骨分化效果為進一步驗證Wnt/β-catenin 信號通路在STR+SIM 組促BMSCs 成骨分化中的作用，使用Wnt/β-catenin 特異性阻滯劑DKK1 進行處理，結果顯示使用DKK1 后STR+SIM 組ALP 活性下降（P＜0.05，圖4D），表明STR+SIM 通過Wnt/β-catenin 信號通路促進BMSCs 成骨分化。

3 討論

辛伐他汀已被證明具有促成骨分化能力，但其在牽張成骨中的作用及具體機制尚不清楚。本研究從體外探討辛伐他汀對機械刺激環境下BMSCs 增殖及成骨分化的影響及其機制，結果顯示適量的機械牽拉及辛伐他汀均能促進BMSCs 成骨分化，辛伐他汀能增加機械牽拉促BMSCs 成骨分化效果，且這一過程與激活Wnt/β-catenin 信號通路密切相關。

圖4 各組β-catenin 通路基因蛋白表達及ALP 活性Fig.4 The expression of β-catenin and the level of ALP activity in each group

大量的研究［9］探討機械牽拉對BMSCs增殖及成骨分化的影響，但研究結果尚不完全一致。CHEN等［10］設置機械牽拉裝置為1 Hz，以2.5%、5%及10%機械牽拉作用于人BMSCs，探討不同大小的機械牽拉刺激對人BMSCs 氧化及成骨分化的影響，結果表明機械牽拉對人BMSCs 具有抗氧化應激及促成骨分化作用；TAN 等［11］研究發現過度的機械刺激可通過誘發BMSCs 氧化應激減弱BMSCs 成骨分化。機械牽拉對BMSCs 增殖及成骨分化的影響主要受牽拉裝置類型、牽拉應變率、牽拉頻率及作用時間等因素影響［12］。且機械牽拉對BMSCs 的影響與刺激力的大小密切相關，過小或過大的機械刺激對BMSCs 無明顯作用甚至有害，只有適量的機械刺激可引起BMSCs 增殖及成骨分化［13］。本研究選擇頻率為1 Hz 的10%牽拉力作用于大鼠BMSCs 7 d，結果表明其能促進BMSCs 成骨分化，這一結果與既往文獻及以往研究結果一致［14］，為進一步研究提供基礎。

MUNDY 等［15］首次發現他汀類藥物能提高細胞成骨基因表達。隨后大量體內外研究發現他汀類藥物具有促成骨分化能力。FENG 等［8］發現適量濃度的辛伐他汀可通過BMP-2/Smads 信號通路促進BMSCs 成骨分化發揮抗骨質疏松作用。LIN等［16］發現辛伐他汀在預防和治療骨質疏松中發揮重要作用。楊建輝等［17］探討不同濃度辛伐他汀對成骨細胞成骨分化的影響，結果發現辛伐他汀對成骨細胞增殖與濃度相關，辛伐他汀大于10-8mol/L可以增加成骨ALP 的表達含量，過低則無明顯促成骨作用，表明辛伐他汀對成骨細胞增殖存在明顯的量效關系。本研究發現10-7mol/L 辛伐他汀能夠促進BMSCs 成骨分化，與以往文獻結果一致。

辛伐他汀（生物因子）及機械牽拉（物理因子）均能促進BMSCs 增殖和成骨分化，但聯合應用辛伐他汀及機械牽拉對BMSCs 成骨分化的影響尚不清楚。本研究聯合應用10-7mol/L 辛伐他汀及10%機械牽拉作用于BMSCs，檢測其對BMSCs 成骨分化的影響，結果表明辛伐他汀能夠增加10%機械牽拉促BMSCs 成骨分化效能，ALP 及OCN 反應了BMSCs 成骨分化的早期和晚期階段，結果顯示機械牽拉聯合辛伐他汀對BMSCs 早期及晚期成骨分化均有促進作用。這些結果表明辛伐他汀可協同機械牽拉促進BMSCs 成骨分化，為辛伐他汀促牽拉成骨提供理論基礎。

Wnt/β-catenin 信號通路是Wnt 通路中的“經典途徑”，與骨代謝密切相關［18-19］。Wnt 蛋白將信號導入后與frizzled 受體結合，Wnt 信號通路激活時，GSK-3β被募集并磷酸化LRP6，而不能磷酸化βcatenin 從而避免被其降解［20］。以往研究表明辛伐他汀及機械牽拉均可通過Wnt/β-catenin 信號通路促進BMSCs 增殖及成骨分化。本研究發現辛伐他汀、機械牽拉及機械牽拉聯合辛伐他汀均能增加BMSCs 中β-catenin 基因及蛋白表達含量，且機械牽拉聯合辛伐他汀組β-catenin 表達升高最明顯。為進一步驗證機械牽拉聯合辛伐他汀是否通過Wnt/β-catenin 信號通路促進BMSCs 成骨分化，采用Wnt/β-catenin 通路阻滯劑DKK1 預處理，結果發現DKK1 能夠抑制機械牽拉聯合辛伐他汀促BMSCs 成骨分化效能。這些結果表明機械牽拉聯合辛伐他汀通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進BMSCs 成骨分化。

綜上所述，適當大小機械牽拉及辛伐他汀均能促進BMSCs 成骨分化，辛伐他汀能提高機械牽拉促BMSCs 成骨分化能力，且與激活Wnt/β-catenin 信號通路密切相關。該研究為辛伐他汀用于促牽張成骨提供理論基礎，今后將進一步建立牽拉成骨模型探討辛伐他汀對牽張成骨的影響并深入探討Wnt/β-catenin 信號通路在其中的作用。