基于生物信息學的潰瘍性結腸炎免疫細胞的浸潤模式分析

李 娜 陶弘武 柳越冬 林亞南 許博佳 羅瑞娟 王 磊 姜莎莎

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種特發性復發性炎癥性疾病，發病率較高。雖然UC的病因尚不清楚，但其特征表現為連續性腸道黏膜的炎癥，從直腸開始，并可累及整個結腸。環境和生活方式與藥物使用、高糖和高脂肪的飲食、污染、較高的社會經濟地位、壓力與UC有關，免疫反應在UC的全過程中起重要作用。免疫耐受的喪失導致各種免疫炎癥因子的增加而誘發炎癥。它們刺激抗原特異性效應物的增殖，從而觸發適應性免疫系統，導致局部和全身炎癥。UC的免疫應答和炎癥途徑表明，各種類型的細胞，包括抗原呈遞細胞、T輔助細胞、調節性T細胞和自然殺傷T細胞，通過調控炎癥在UC發病中發揮重要作用。本文利用GEO數據庫中UC的微陣列測序， 并利用CIBERSORT[1]計算其免疫細胞組成， 進一步分析其與UC的相關性,并初步評估 UC中免疫細胞浸潤情況，為進一步研究 UC 的分子機制提供了新思路。

1 材料與方法

1.1數據下載 數據采集本研究利用了GEO[2]數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的數據。MeSH檢索詞為“colitis,ulcerative”或“Ulcerative colitis”和“Homo sapiens”和“Expression profiling by array”和“tissue”，GSE11223微陣列測序數據集[3]，樣本通過Agilent-012391全人類基因組Oligo微陣列測序，平臺文件為GPL1708，包括了67例UC患者腸道不同解剖部位的上皮活檢分析，病理結果分為炎癥組織和非炎癥組織，剔除非炎癥組織。此外，該數據集還包含了31例正常對照組腸道不同解剖部位上皮組織樣本，剔除其中8個病理報告為假膜性結腸炎、例憩室炎、阿米巴病等[3]炎癥的組織樣本。

1.2數據預處理 使用R軟件[4](version 4.0.3,http://r-project.org/)的affy包[5]分別讀取兩個數據集的原始數據，通過RMA算法[6]分別進行背景校正、數據歸一化處理。然后在Bioconductor[7]應用GPL1708平臺所對應的基因注釋文件對探針矩陣進行注釋。將基因表達數據集是使用標準的注釋文件和數據上傳到CIBERSORT網站門戶[8](http://cibersort.stanford.edu/)， CIBERSORT是一種基于基因表達的反卷積算法[9]中，對每個樣本以CIBERSORT值P<0.05為標準篩選，將過濾后的免疫細胞表達矩陣與 GEO的信息矩陣融合,并對UC的免疫細胞進行評價。

1.3數據處理和免疫細胞浸潤的評估 在GSE11223微陣列中，原始樣本數目為202，從UC中剔除病理報告為非炎癥組織的樣本，獲得63個樣本；同時在正常對照組中，剔除病理報告為炎癥組織，獲得69個樣本，應用CIBERSORT標準，P<0.05進行過濾，有44個UC樣本和31個正常樣本符合過濾條件。

1.4統計學方法 使用R語言4.0.3版本，應用arrayImpute、arraryMissPattern軟件包處理微陣列缺失值，因缺失數據很少，采用簡單插補，即用均值來替換變量中的缺失值。使用barplot函數繪制其22種浸潤免疫細胞的占比柱狀圖，應用pheatmap包分別分析和繪制免疫細胞表達熱圖，采用vioplot包繪制小提琴圖，使用corrplot包繪制不同免疫細胞間的占比相關圖。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1樣本數據標準化 圖1為GSE11223中69個正常對照組樣本和63個UC組織樣本的基因表達量，用R 語言的ggplot2包和boxplot函數繪制未校正的原始箱式圖。隨后進一步應用affy包和其中的rma函數，其中normalize.method使用的quantiles方法，無需假設任何參數，對差異表達基因數據進行標準化及處理，然后以箱式圖(圖2)呈現，使得各個樣本數據處于相同的水平，從而得到具有生物學意義的基因表達量的變化情況。

圖1 樣本未經校正的原始箱式圖Fig.1 Uncorrected original box diagram of SamplesNote:The graph is GSE11223 in the normal control group (69 samples) and ulcerative colitis patients (63 samples)gene expression level of boxplot.

圖2 樣本表達校正箱式圖Fig.2 Sample expression correction box diagramNote:The mean value of gene expression after sample normalization[10].

2.2UC組織免疫細胞占比和含量分析 圖3和圖4聯合分析所示， 在UC組織中浸潤水平最高的10種免疫細胞類型分別是:幼稚B細胞、靜息狀態下記憶CD4+T細胞、活化的CD4+記憶性T細胞、M2巨噬細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、CD8+T細胞、靜息狀態下的肥大細胞、激活的自然殺傷細胞、濾泡輔助性T細胞、調節性T細胞。

圖3 GSE11223樣本中22種免疫細胞占比的柱狀圖Fig.3 Histogram of proportion of 22 kinds of immune cells in GSE11223 samples

2.3對UC免疫細胞進行無監督聚類分析 使用免疫細胞比例進行的無監督聚類分析顯示了5個亞群，如圖4所示。細胞亞群1由樹突狀細胞(活化)、肥大細胞(活化)、自然殺傷細胞(靜息)、單核細胞、調節性T細胞構成。細胞亞群2由活化的 CD4+記憶性T細胞、M1巨噬細胞、CD8+T細胞構成。細胞亞群3由自然殺傷細胞(活化)、M2巨噬細胞、肥大細胞(靜息)組成。細胞亞群4由M0巨噬細胞、γδT細胞組成。細胞亞群5由幼稚B細胞、靜息狀態下記憶CD4+T細胞組成。研究表明，相對于細胞亞群3和細胞亞群4功能的失調，細胞亞群1、細胞亞群2的活躍，上述主要細胞亞群的變化差異是UC的發生發展的直接原因。

圖4 GSE11223樣本中22 種免疫細胞含量熱圖Fig.4 Heatmap of 22 immune cells in GSE11223 samplesNote:The blue control group represents the normal control group,and the red Treat group represents ulcerative colitis group.

2.4免疫細胞在正常對照組和UC組的比例差異 與UC組織相比，在正常組織中，M2巨噬細胞、未活化的樹突狀細胞的比例普遍較高(P<0.05)。與正常組織相比，在UC組織中活化的 CD4+記憶性T細胞、調節性T細胞、單核細胞、中性粒細胞、M0巨噬細胞、活化的肥大細胞、未活化的肥大細胞的比例普遍較高(P<0.05)，見圖5。

圖5 樣本免疫細胞占比小提琴圖Fig.5 Proportion of immune cells in a violin diagramNote:Samples of normal control group and inflammatory tissue samples of patients with ulcerative colitis from GSE11223.Green represents normal control group,blue represents ulcerative colitis group.

2.5UC組織免疫細胞的相關分析 圖6可見，在UC組織中，構成比相關系數較大的免疫細胞包括:負相關的可見未活化的CD4+記憶性T細胞與CD8+T細胞(-0.5)，未活化的CD4+記憶性T細胞與活化的CD4+記憶性T細胞(-0.43)，幼稚B細胞與漿細胞(-0.52)，幼稚B細胞與記憶B細胞(-0.49)，幼稚B細胞與M1巨噬細胞(-0.49)，M2巨噬細胞與M0巨噬細胞(-0.56)，以上負相關提示活化的CD4+記憶性T細胞、CD8+T細胞與未活化的CD4+記憶性T細胞之間在UC疾病進程中相互抑制。正相關的可見活化的肥大細胞與活化的樹突細胞(0.64)，活化的肥大細胞與中性粒細胞(0.47)，活化的樹突細胞與中性粒細胞(0.42)，上述正相關提示活化的樹突細胞、活化的肥大細胞、中性粒細胞三種免疫細胞在UC疾病過程中具有相互協同作用的關系。

圖6 UC組織樣本中每種免疫細胞占比相關圖Fig.6 Correlation of proportion of each immune cell in ulcerative colitis tissue samples

3 討論

UC是一種慢性結腸特發性炎癥性腸病，可引起從直腸向近端結腸持續的黏膜炎癥，且炎癥程度不一，UC接受藥物治療的患者需要持續長時間應用皮質類固醇控制，因此解決UC免疫反應成為當務之急。固有免疫是病原微生物入侵腸道黏膜的第一道防線。本研究從全人類基因組Oligo微陣列數據分析的角度開展。在正常組織中，巨噬細胞M2(P=0.014)、靜息樹突狀細胞(P=0.012)高表達。而UC參與固有免疫的特征性細胞有單核細胞(P=0.037)、巨噬細胞M0(P=0.001)、中性粒細胞(P=0.011)，上述細胞初次與抗原接觸即能發揮效應，但無記憶性，也是特異性免疫的基礎。

在談到特異性免疫時，樹突狀細胞一直被認為是體內唯一能夠將抗原提呈給初始狀態CD4+T細胞的抗原提呈細胞。樹突狀細胞轉化為適應性免疫反應，活化的樹突狀細胞停留在上皮屏障附近，和黏膜固有層的巨噬細胞一起激活局部適應性反應[11]。現在已有研究證實B細胞表達的Toll樣受體及其信號通路對CD4+T細胞的活化和分化發揮著關鍵作用，刷新了CD4+T細胞對抗病原微生物過程的反應的認識[12]。

圖7系統地展示了本研究的結果。在本項研究中，CD4+記憶性T細胞在UC與正常組織之間存在顯著差異(P<0.05)，在UC組織中，CD4+記憶性T細胞的比例普遍高于正常組織。生理正常狀態下，CD4+記憶性T細胞是體液免疫中由B細胞分化而來的一種免疫細胞。CD4+記憶性T細胞在抗原二次感染細胞時，可直接增殖、分化產生效應T細胞。CD4+記憶性T細胞可在人體內存在數月，甚至幾十年，使人體避免受到相應病原體的二次侵入。研究證實病理狀態下，腸道內CD4+T細胞[13]、調節性T細胞浸潤，CD4+T細胞和調節性T細胞的基線百分比與UC結局相關[14]。 CD4記憶效應T細胞,可以導致IL-7表達水平增高,誘導腸道黏膜固有層炎癥發生。而調節性T細胞的IL-8+Foxp3+細胞亞群在UC的微環境中，不僅抑制人體免疫反應，還可誘導關鍵的炎癥細胞因子，調動中性粒細胞聚集和轉運，中性粒細胞表達量的顯著差異,從側面支持了中性粒細胞在急性黏膜炎癥和損傷中扮演重要角色,由于大量炎癥細胞存在于結腸導致的隱窩膿腫[15-17]。甚至促進啟動潰瘍性大腸癌的發生。

圖7 基于GSE11223微陣列數據集，UC免疫特征性細胞在固有性免疫及特異性免疫的差異表達Fig.7 Based on GSE11223 data set, characteristic cells in UC were differentially expressed in innate immuni-ty and specific immunityNote:① In UC tissue, antigen-presenting cells (dendritic cells, macrophages, B cells) react with naive CD4+T cells，which activated CD4+T cells (P<0.05); ②TLR signal expressed by B cells also promotes the activation of CD4+T cells;③CD4+ memory T cells showed significant difference between ulcerative colitis and normal tissue (P<0.05);④The characteristic expression of macrophage M2 is decreased in UC (P<0.05), considering that the polarization of M2 induced by PPAR is inhibited[26-29];⑤The characteristic cells involved in the innate immunity of UC are monocytes (P=0.037), macrophage M0 (P=0.001) and neutrophils (P=0.011).

盡管目前有研究指出UC患者巨噬細胞表型向M1轉移，呈現高促炎細胞因子分泌，可增強細胞毒性和吞噬能力[18，19]。而本研究表明，M1巨噬細胞在UC與正常組織之間不存在顯著差異(P>0.05，圖5所示)。在UC組織中M0巨噬細胞的比例普遍較高(P<0.05)。而在UC組織中M2巨噬細胞的比例普遍較低(P<0.05)。在一項對兒童UC研究的芯片數據集GSE87473進行免疫細胞浸潤分析顯示[20]，兒童UC中調節性T細胞、單核細胞、M0巨噬細胞和活化肥大細胞比例較高，而M2巨噬細胞和活化樹突狀細胞比例在UC的患者中較低，在該項研究中，M1巨噬細胞也不存在特征性差異，與本研究分析結果具有一致性。目前已知M2 巨噬細胞,參與了潰瘍性大腸癌腫瘤血管生成，在克隆恩病和結直腸癌中高表達，其發生機制為IL-4/IL-13和IL-10激活STAT3和STAT6時，增加巨噬細胞M2的極化水平有關[21-23]。但作為巨噬細胞M2的轉錄因子，PPARγ缺失均導致巨噬細胞M2極化受到抑制[24,25]，目前也被認為是導致巨噬細胞M2在潰瘍性結腸炎中特征性低表達的原因之一[26-29]。

本研究應用生物信息學分析技術，基于CIBERSORT研究方法，分析了正常結腸組織和UC組織的全人類基因組Oligo微陣列測序，它提供關于UC免疫細胞的明確信息。

本研究結果表明，CD4+記憶性 T 細胞、巨噬細胞M2型、調節性T細胞和UC的發生發展密切相關，而這些特征性免疫細胞可能是藥物治療作用效應的重要決定因素，也是免疫治療評估的中心焦點，更能為UC患者的治療評估策略提供標志性參考。