MicroRNA參與水生動物環境污染物脅迫應答的 研究進展

王夢婷 曹杰宇 王忠新 王雅瑜 楊大佐 周一兵 趙歡

（1. 大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，大連 116023；2. 大連海洋大學 農業農村部北方海水增養殖重點 實驗室，大連 116023）

Micro RNA（miRNA）是一類長度約為18-24個核苷酸的非編碼內源RNA［1］，1993年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中首次發現miRNA（lin-4），目前在植物、動物、細菌和部分病毒中都發現miRNA的存在。動物miRNA的合成包括初級轉錄本miRNA，前體miRNA到成熟miRNA三個階段。細胞核內編碼miRNA的基因通過RNA聚合酶II轉錄形成初級轉錄本miRNA，即pri-miRNA，pri-miRNA包含5′端帽子和3′端多聚腺苷酸尾巴結構。pri-miRNA隨即在核糖核酸酶RNase III（double- strand specific ribonuclease，Drosha） 作 用 下 形成60-70個堿基的發卡狀結構前體miRNA（premiRNA）［2］。pre-miRNA 隨后被轉運蛋白Exportin-5從細胞核中轉運至細胞質［3］，經Dicer剪切成為雙鏈復合體結構［4］。雙鏈復合體解鏈形成成熟的miRNA，成熟的單鏈miRNA與RNA誘導的沉默復合物RISC（RNA-induced silencing complex）結合而發揮作用。雖然miRNA序列較短，但是已有研究發現其在基因表達中起到重要作用。miRNA與特異性的靶目標mRNA進行不完全互補配對，通過誘導靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯等方式對基因表達進行調控［5-6］。已有報道表明miRNA參與動物細胞發育［7］、分化［8］、增殖和凋亡［9］、免疫［10］、脂肪代謝［11］等多種生命活動。

水生生物生活離不開水，水環境的改變會對水生生物機體穩態產生影響，重金屬、有機污染物等問題已嚴重影響水生生物的生存及水生生態系統的穩定。越來越多的證據表明 miRNA在水生生物外源環境因子脅迫應答中發揮著不可或缺的作用，如在重金屬或有機污染物等污染脅迫下，miRNA通過調控細胞發育或凋亡、機體解毒代謝及改變機體耐受性等過程，參與機體對污染物的毒性響應。本文對在不同類型環境污染物脅迫下，水生生物體內miRNA參與調控的機制進行綜述，以期為后續系統開展miRNA參與水生動物抗逆性方面的研究奠定一定的理論基礎。

1 環境污染物脅迫下miRNA的響應機制

1.1 重金屬脅迫下miRNA的響應機制

重金屬在環境中普遍存在，可通過呼吸、體表滲透、攝食等方式進入水生動物體內，但重金屬在動物體內不易降解，因此會長期蓄積在動物體內，進而引起細胞凋亡，影響機體生長發育［12］。不同種類的水生動物對重金屬的耐受性存在差異，在無脊椎動物貝類和節肢動物中發現miRNA參與機體對重金屬的耐受性。Bao等［13］將泥蚶（Tegillarca granosa）暴露于250 μg/L鎘24 h后發現，泥蚶血淋巴中16個miRNAs出現了差異表達，其中TgrnmiR-21表達量出現明顯下調，并調控陽離子擴散促進子（cation transport and diffusion facilitators，CDF）相關蛋白，進而改變生物體內金屬穩態性和耐受性。Chen等［14］發現暴露于20 μg/L鎘中48 h會引起淡水枝角水蚤（Daphnia pulex）體內21個miRNAs表達發生改變，miR-71和miR-210出現明顯上調，靶向調控SCN2A、SLC31A1基因，進而參與機體的離子運輸，其中miR-71是Ca2+信號抑制劑，其表達量的上調會抑制Ca2+的信號傳導，進而改變鎘誘導下淡水枝角水蚤的離子穩態。Chen等［15］進一步發現將淡水枝角水蚤（D. pulex）暴露于10 μg/L鎘繁育25代后進行凈化，凈化的子二代和子三代淡水枝角水蚤體內miR-33、miR-252表達下調，預測miR-33、miR-252可能通過調控GTPase通路，抑制細胞生長和增殖，進而達到增加機體鎘耐受性的目的。

miRNA除了可以改變水生動物重金屬耐受性，還會通過調控水生動物的免疫應激和解毒代謝參與機體對重金屬的毒性效應，已有報道表明鎘可引起魚體內參與應激調控的相關miRNA表達發生變化，進而影響下游基因的表達。Liu等［16］將錦鯉（Cyprinus carpio）暴露于0.275 mg/L鎘中30 d，結果發現魚體前腎中miR-122、novel-miR6、miR-193a-3p表達顯著下調，而miR-27a-5p表達顯著上調，靶向 上 調BAX、BAD、BAK、CASPASE9和 PIDD基因，其中miR-122和miR-193a-3p參與機體抗炎和抗腫瘤過程，而miR-27a-5p則會抑制炎癥反應，這些miRNAs的變化表明鎘脅迫可能會引起錦鯉前腎細胞凋亡。Qiang等［17］發現暴露于12 mg/L鎘的羅非魚（Oreochroms mossambcus）體內miR-122表達明顯下調，其通過與MT3′UTR結合，降低熒光素酶活性，促進機體金屬硫蛋白（metallothionein，MT）的表達，證實miR-122在羅非魚應激反應的調節中也起重要作用。重金屬脅迫下，miRNA的差異表達在甲殼類和貝類也有相關報道。Guo等［18］將凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）暴露于5 mg/L銅中發現，miR-1175a-3p、novel-miR-46、miR-228、novel-miR-8及其調控的靶向基因（機體免疫反應、細胞凋亡及外源物質代謝相關基因如細胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）、凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）等）表達出現顯著變化，表明miRNAs可能參與凡納濱對蝦抵御重金屬脅迫的調控。張晶晶等［19］將中國蛤蜊（Mactra chinensis）暴露于2.76 mg/L鎘中48 h，發 現miR-2202-5p、miR-963-3p和miR-216c-3p表達顯著上調發現，蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）活性下降，通過介導AMP-激活蛋白激酶α（AMPKα）的去磷酸化來調控熱休 克 蛋 白（heat shock proteins，HSP）中HSP70和HSP27的表達并參與細胞應激反應，預測這些miRNAs可能參與重金屬脅迫下機體的免疫調節。以上研究結果表明，miRNA可以作為重金屬對水生動物毒性效應的分子標記，調控解毒代謝及免疫調節相關靶基因，進而引起機體反應。

1.2 有機污染物 脅迫下miRNA的響應機制

除重金屬以外，有機物也是一類廣泛存在于水生環境中的污染物，已有大量研究表明有機污染物暴露會影響水生生物個體發育、性腺分化等多個生理生化過程，miRNA可參與有機污染物脅迫下水生生物體內生理活動的調控。目前在模式生物斑馬魚（Danio rerio）胚胎中已開展部分研究，發現miRNA可調控有機污染物脅迫下斑馬魚胚胎心臟發育。王菊等［20］發現暴露于10 mmol/L丙烯酰胺（acrylamide，ACR）的斑馬魚胚胎體內miR-21表達上調，miR-21靶向調控心臟形成關鍵調節因子Hand2基因的表達，進而可能影響斑馬魚心臟細胞的生長和分化過程。Wu等［21］發現暴露于六溴環十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD）的斑馬魚胚胎體內miR-1表達下調進而抑制nkx2.5基因表達，預測miR-1參與六溴環十二烷暴露下斑馬魚心臟發育的調控。Jenny等［22］將斑馬魚胚胎暴露于5 nmol/L的2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）60 hpf后發現，miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-27e和miR-451表達發生改變，調控AHR通路，其中miR-23a和miR-24的上調可能與TCDD引起斑馬魚心臟發育畸形相關。miRNA不僅可對有機污染物脅迫下斑馬魚胚胎心臟發育進行相關調控，也可影響骨骼、神經系統發育。Ju等［23］發現多氯聯苯（polychlorinated biphenyl，PCB）（PCB1254）暴露下斑馬魚胚胎體內miR-21表達上調，抑制骨形態發生蛋白受體Ⅱ（bone morphology protein receptor II，BMPRII）表達，影響斑馬魚胚胎骨骼發育。Zhang等［24］將受精后6 hpf 至120 hpf的斑馬魚胚胎暴露于10 mg/mL全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulphonate，PFOS）中發現，PFOS會引起20個miRNAs表達出現上調，19個miRNAs表達下調，預測其中表達上調的miR-19b-c可靶向調控如Cdk5、smad1、sox11b和pou5f1等多種基因，進而調控神經系統發育。也有研究表明miRNA在有機污染物脅迫下斑馬魚的細胞凋亡和信號傳導的改變中也起重要作用。

miRNA不僅參與有機污染物脅迫下斑馬魚胚胎發育的調節，在有機污染物對斑馬魚免疫毒性效應中也具有一定的調控作用，可以調控斑馬魚的免疫防御及細胞凋亡過程。Huang等［25］和Zhou等［26］發現暴露于氟蟲腈的成年斑馬魚體內miR-155，miR-216b和miR-499表達下調進而調控cyb561d2基因表達上調，預測其參與氟蟲腈脅迫下斑馬魚體內的免疫調節。Wang等［27］發現成年斑馬魚單獨和聯合暴露于30%三唑磷（triazophos）和1%氟蟲腈（fipronil）96 h，體內miRNAs表達存在差異。三唑磷暴露下，魚體內miR-21、miR-31、miR-203b和miR-455表達上調，miR-135c、miR-30b和miR-365表達下調；氟蟲腈暴露下，魚體內miR-199、miR-22b和miR-499表達下調；聯合暴露下，魚體內miR-735表達上調，miR-128、miR-9表達下調，其中miR-181a是唯一一個在兩種污染物中均出現表達上調，預測其可通過靶向 BCL-2、CD69基因，進而調控機體免疫反應。Jia等［28］發現成年斑馬魚暴露于不同濃度三唑磷中體內miR-217表達出現下調，其調控的靶基因nup43表達上調，進而調控細胞凋亡。

部分有機污染物（如雙酚A，雙酚S等）屬于環境內分泌干擾物，可以影響生物激素代謝，進而產生生殖毒性效應。在模式生物斑馬魚中已發現miRNA參與生物對有機污染物對生殖毒性響應。Renaud 等［29］對0.125 nmol/L的雙酚A（bisphenolA，BPA）暴露下斑馬魚肝臟組織中miRNA表達進行分析 發 現，14個miRNAs（miR-725、miR-724、miR-499-3p、miR-458、miR-430c、miR-430a、miR-430b、miR-499-5p、miR-205、miR-202、miR-193a、miR-184、miR-133a和miR-122）表達上調，1個miRNAs（miR-2189）表達下調，這些miRNAs可能靶向上調insrb、eif2ak3、traf2a基因，并參與機體生殖及激素代謝調控。Lee等［30］將雄性斑馬魚暴露于5 μg/L和50 μg/L雙酚S（bisphenol S）21 d，結果發現 性腺中dre-miR-30c、miR-192、miR-430a、miR-430b、 miR-454和miR-499表達下調，這些miRNA靶向上調參與激素轉化的cyp19a1基因表達。miR-430是機體生殖調控的重要調節，以斑馬魚nanos1的3′UTR 作為靶點，誘導體細胞的mRNA的凋亡、降解，進而調控激素代謝。脊椎動物中除斑馬魚外，部分學者亦研究了多環芳烴暴露下稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）［31］和 文 昌 魚（Branchiostoma belcheri）［32］中miRNAs的表達變化，以及阿特拉津和來曲唑（Letrozone，LET）暴露下黃河鯉（Cyprinus carpio）幼魚性腺miRNA靶基因表達變化發現［33］，這些魚體中 miRNAs也參與機體解毒代謝和性腺分化相關調控。以上可以看出有機污染物脅迫下，miRNA參與魚類發育、代謝等多方面的調控，但目前關于miRNA參與調控有機污染物對水生動物的研究集中于脊索動物門，在無脊椎動物中相關研究尚未見報道。

1.3 新型污染物脅迫下miRNA的響應機制

隨著納米材料（nanoparticles，NPs）在醫藥、化妝品、能源等領域的使用，納米產品的使用日益廣泛，據估計截止到2019年，全球納米產品的消費量達到5.8×105t［34］。納米材料在生產和使用過程中會釋放入環境，對環境產生潛在危害。目前在斑馬魚中證實miRNA參與調控納米材料對水生生物的毒性效應。Hu等［35］將斑馬魚暴露于硅納米粒子（silica nanoparticles，SiNPs）發現，miR-223負向調節中性粒細胞分化，進而可能參與炎癥的調節過程。Hu等［36］發現硅納米顆粒和甲基汞（MeHg）聯合暴露下，斑馬魚miR-375和miR-206表達量增加，miR-7147和 miR-26a表達量降低，通過調控stxbp1a、celf4、ahr1b、bai2基因，參與調節心臟肌肉收縮，進而影響心血管系統。

藥品及個人護理品（pharmaceutical and personal care products，PPCPs）包括各類處方藥和非處方藥（如抗生素、抗癲癇藥和抗抑郁藥等）、化妝品、香料等，PPCPs與人類的生活密不可分，所以在環境中普遍存在。近年來越來越多的研究發現PPCPs進入環境會對生物產生毒性效應，而miRNA也參與PPCPs對生物體的毒性效應調控。Martinez等［37］將斑馬魚分別暴露于54 μg/L氟西汀5個月和9個月后進行繁殖，結果發現，5個月時，斑馬魚卵中miR-25、miR-26、miR-30d、miR-92a、miR-103表達上調，miR-740表達下調；9個月時，斑馬魚卵中miRNA-30d 和 miRNA-92a 表達量增加。其中miR-25、miR-740可分別靶向上調fkbp5、pomcb，預測發現這些miRNAs可能參與調控機體應激反應。

PPCPs脅迫下，miRNA可主要影響斑馬魚體內代謝反應，Lin等［38］將斑馬魚暴露于不同濃度三氯生（Triclosan，TCS）中，發現miR-125b、miR-205、miR142a和miR-203a 表達上調，證實pri-mir-125b1和 pri-mir-125b-3參與了Nfe2l2 的調控，進一步預測miRNA可通過靶向調控影響脂肪酸合成及代謝。Wang等［39］發現暴露于β-二酮類抗生素（β-Diketone antibiotics，DKAs）中斑馬魚體內miR-125b、miR-144表達上調，抑制ppardb、bcl2a、pparaa、pparda基因表達，進而可能影響機體脂肪代謝反應。Craig等［40］對暴露于540 ng/L氟西汀（fluoxetine，FLX）的斑馬魚體內miRNAs進行表達分析發現，drelet-7d和dre-miR-140-5p表達上調，預測其可以通過調節單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）α1和α2，進而影響肝臟代謝。

miRNA也參與PPCPs暴露下斑馬魚神經發育的毒性響應。Liu等［41］將斑馬魚暴露于不同濃度三氯生中，發現體內miR-137表達量顯著增加，但其靶向基因（bcl11aa、MAPK6、Runx1）表達量降低，通過調控MAPK 信號通路，影響斑馬魚的神經發育。Aluru等［42］對暴露于不同濃度丙戊酸（Valproic acid，VPA）中的斑馬魚胚胎體內miRNAs表達分析發現，暴露48 hpf時，4個miRNAs（miR-16a、18c、22a和457b）表達上調，9個miRNAs（miR-96、122、124、132、135a、140、182、182*和724）表達下調；暴露96 hpf時，11個miRNAs（miR-10b、10c、16a、16b、18c、22b、210*、217、451、455和457b）表達上調，11個miRNAs（miR-21、27c、29a、29b、34、122、132、192、194a、212和724）表達下調。96 hpf時，這些miRNAs抑制靶基因bdnf、ncor2和 mmp9的表達，通過靶基因預測發現部分上調表達 miRNAs 參與癌癥和細胞循環通路，而下調表達的 miRNAs 參與了 MAPK 激酶信號傳導，進而影響斑馬魚的神經發育。此外，Li等［43］用微量β-雙酮類抗生素（β-diketone antibiotics，DKAs）脅迫斑馬魚，發現miR-184表達下調，而miR-10c和miR-92a 表達下調，預測miR-92a可靶向slc2a3基因，進而導致心臟缺陷。

另外，Duan等［44］發現斑馬魚暴露于顆粒物（particulate matter，PM）PM2.5中，miR-7a、miR-7ab和miR-19b-3p 出現表達下調，通過調控cyp3a65、mgst2、gstp1、gsto2、aldh3b1和ephx1等基因，進而可能對心肌細胞起保護作用，并抑制心肌纖維形成，調節免疫反應。但與有機污染物相類似，目前關于新型污染物暴露下水生動物miRNA調控的研究也是主要集中于斑馬魚，其他水生脊椎動物及無脊椎動物相關報道尚未見報道。

2 存在問題及展望

通過以上研究可以發現，外源污染物暴露會引起水生動物體內miRNA表達發生變化，miRNA可以通過調控細胞生長發育、機體代謝、免疫應激等多種過程，參與機體對外源污染物的毒性響應。但是，由于水生動物基因組研究相對緩慢，miRNA和靶基因之間調控功能的研究更多集中在模式生物斑馬魚，而其它水生脊椎動物及無脊椎動物中研究主要集中在miRNA數量的確認和功能的預測，并且由于背景信息的缺失，通過高通量測序獲得的許多miRNA處于未知狀態，隨著轉錄組學及基因組學的廣泛應用，miRNA在水生動物抗逆性調控的機制將不斷深入。

miRNA參與生物毒性效應表明miRNA在生物抗逆性中的重要性，研究發現，miRNA具備多重靶向性，一個miRNA可以同時靶向調控多個基因，一個基因也可被多個miRNA調控，miRNA的多靶向特征使其擁有巨大的調節潛力。例如，miR-125在不同污染物脅迫下，分別靶向調控Nfe2l2以及ppardb、bcl2a、pparaa、pparda基因，參與調控脂肪代謝反應，進而證實一個miRNA可以靶向調控多個基因。此外，王菊等［20］的研究發現miR-21表達的變化與斑馬魚心臟形成關鍵調節因子Hand2基因的表達相關，參與斑馬魚心臟細胞的生長和分化過程，而Ju等［23］的結果表明多氯聯苯PCB1254暴露下斑馬魚胚胎中miR-21表達上調可能與骨形態發生蛋白受體基因表達相關，影響斑馬魚骨骼的發育。Beate等［45］發現miR-21在鳉魚中可負反饋調節igfbp3和 fosl1等下游基因，進而在腎臟中起增殖、凋亡作用。可以發現在不同生物中，同一miRNA調控功能不同，有關miRNA上游調控因子的鑒定和相關實驗的驗證仍需深入開展，進而深入闡明miRNA如何通過同一下游因子進而調控不同的生物學過程的分子機制。miRNA在具有多功能性的同時，也具有一定的保守性，在脊椎動物、無脊椎動物中均有已知的保守miRNA，如miR-21，不僅存在于斑馬魚等高等脊椎動物中，在泥蚶中也有報道［13］，但這些保守miRNA在不同物種間是否存在相同功能，尚未研究明確，還屬未知。在以后的研究中，可以對同一miRNA是否在不同物種中具有相同調控功能，進行更深入的研究。

隨著高通量測序技術的提高以及miRNA 研究方法的不斷改進，利用不同研究手段去發掘水生動物miRNAs，并清晰闡述不同水生動物體內miRNA的種類及其在外源污染物暴露下的作用機理與調控途徑將會為深入了解水生生物的抗逆性提供重要的理論依據。