基于線粒體基因的云南省煙田煙蚜繭蜂的種群遺傳多樣性研究

馮增貝，張翠萍，李紅娟，杜振勇，李 虎，周文兵

(1 中國農業大學 植物保護學院昆蟲學系，北京 100193；2 云南煙草公司，玉溪市分公司，玉溪 653100)

蚜蟲是一類重要的農業害蟲，其繁殖率高、生命周期短、防治難度大.長期以來使用化學農藥防治，使蚜蟲對大多數農藥產生了一定的抗藥性[1].此外，過度使用化學農藥還帶來許多不利后果，如農藥殘留和農業面源污染等，嚴重影響生態環境、農業生產、農產品的質量和安全，威脅人類健康和農業可持續發展[2].生物防治技術利用了生物物種間的相互關系，可以通過一次性或多次引入天敵來抑制害蟲，達到良好的防治效果，大大降低化學農藥的使用[3-4].煙蚜(Myzuspersicae)亦稱桃蚜，是煙草上的常發性害蟲和重點防控對象，寄主包括30科400多種植物[5-8]，能夠傳播100多種病毒[9-10],煙蚜是在煙草整個生長期均有發生，通過刺吸取食煙葉，傳播煙草病原物，造成煙葉的質量和產量下降.

煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensisashmaed)是煙蚜優勢內寄生蜂[5,12-15]，自然寄生率達30%～60%[14]，對煙蚜有較強的控制作用[15].具有產卵量大、壽命長、適應性強的特點，能長時間持續控制蚜蟲危害，在煙蚜的生物防治中具有十分廣闊的應用前景[8].

我國針對煙蚜繭蜂的研究開始于20世紀80年代，主要集中在其生物學、生態學及生物防治利用等方面.趙萬源等[5]曾在云南玉溪煙田對煙蚜繭蜂開展生物學及應用的初步研究，結果表明利用煙蚜繭蜂防治煙蚜的想法是有可能實現的.隨后，湯玉清等[16]、忻亦芬[17]、畢章寶等[18-19]分別在煙蚜繭蜂的生物學、生態學等方面開展了相關研究.2007年，云南煙區開始規模化擴繁和釋放煙蚜繭蜂進行煙蚜的田間防治，并取得了良好的應用效果；經過十多年的研究和應用，云南省主要煙區煙蚜繭蜂繁育和釋放的設施與技術均相對成熟.近幾年，該技術逐漸開始在在全國范圍內推廣應用[20]，目前云南、貴州、廣西、吉林、山東、湖南等國內主要煙區都實現了煙蚜繭蜂的大規模擴繁和產品的開發，并投入到實際生產中[20-25].雖然煙蚜繭蜂具有廣闊的應用前景和良好的防治效果，但是在其工廠化擴繁和人工釋放等過程中仍存在許多問題，尤其是蜂群的退化問題[26].工廠化擴繁的煙蚜繭蜂存在長期近親繁殖、不當引種、飼養環境不良等因素的影響[27]，造成蜂群遺傳多樣性下降和種群的衰退，釋放到田間后適應環境的能力下降，表現出生殖力衰退、寄生效果下降、整體種群競爭力減弱等問題而難以定殖.

目前，關于云南省主要煙田煙蚜繭蜂種群的遺傳多樣性和遺傳結構的特點，以及長期的大規模人工擴繁和田間釋放是否對其種群遺傳多樣性產生了影響等問題尚不明確，相關研究缺乏.本研究利用atp6、cox1、cob和nad2 4個線粒體基因的全序列作為分子標記，對云南省11州市19個樣點的煙田和工廠繁育種群以及1個野生種群的種群遺傳多樣性進行初步研究，為該寄生蜂的科學利用和蜂種合理復壯提供參考.

1 材料與方法

1.1 種群樣品的收集

本研究的樣品于2018—2019年在云南省11市州的煙田、繁蜂工廠和野外蔬菜田采集獲得，其中煙田種群(S)6個，工廠繁育種群(G)13個，野生種群(Q)1個(表1)，樣點的選擇覆蓋了云南主要植煙區域.野外煙蚜繭蜂種群的采集主要是通過采集被寄生的僵蚜，并置于網兜內直到煙蚜繭蜂羽化，立即將其浸泡在無水乙醇中，每個僵蚜個體采集距離不低于5 m，回到實驗室之后，更換一次無水乙醇，置于-20 ℃冰箱內保存.標本經過形態和DNA條形碼鑒定后，進行后續試驗.

表1 云南省主要煙區煙蚜繭蜂種群樣本的采集信息

1.2 基因組DNA提取和線粒體基因數據的獲取

將雌成蜂單頭樣本置于 2 mL 研磨管中，加入1大1小2個滅菌后的研磨珠，使用研磨儀(上海凈信實業發展有限公司，tissuelyser-32)進行研磨，最后使用天根血液/細胞/組織/基因組DNA提取試劑盒(DP304)進行DNA的提取.基因組DNA構建插入片段長度為350 bp的2代測序文庫，利用Illumina NovaSeq 6000(北京貝瑞和康生物技術有限公司)平臺進行150 bp雙端測序.原始測序數據下機后經過質量控制獲得clean data.以本課題組測序完成的煙蚜繭蜂線粒體基因組作為參考序列(GenBank登錄號：MT264907)，選取atp6、cox1、cob和nad2基因序列在測序數據中調取目的片段，利用Geneious 10.1.3(http://www.geneious.com)軟件“map to the reference”操作，參數設置為：最小重疊40 bp，最小序列相似度95%.利用MAFFT[28]軟件對所有個體的線粒體基因分別進行同源比對，最后串聯為1個數據集用于種群遺傳多樣性的分析.

1.3 種群遺傳學分析

利用DnaSP5.10[29]軟件計算單倍型數(number of haplotypes, Ht)、單倍型多樣性(haplotype diversity, Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity, Pi)、平均核苷酸差異數(average number of nucleotide differences, K)、多態性位點數(the number of polymorphic sites, S)等種群遺傳多樣性參數.利用Arlequin3.5[30]軟件計算不同分組變異分布及分化系數(AMOVA)和種群遺傳分化指數(Fst).通過PopART1.7[31]軟件的中值鄰接法構建單倍型進化網絡，利用IQTREE[32]軟件構建系統發育樹，堿基替代模型為自動預測，并進行1000次自展檢驗.

2 結果與分析

2.1 煙蚜繭蜂的種群遺傳多樣性

煙蚜繭蜂4個線粒體蛋白質編碼基因串聯后的總長度為4,359 bp(GenBank登錄號：MT653697～654116).云南省20個種群105個個體中，共有10種單倍型，單倍型多樣性0.501、核苷酸多樣性0.00743、平均核苷酸差異數32.385、多態位點數158.總的來看，核苷酸多樣性最高的是工廠繁育種群，最低的是煙田種群；而單倍型多樣性最高的是普洱野生種群，最低的是煙田種群(表2).

表2 云南省主要煙區煙蚜繭蜂種群遺傳多樣性參數

在6個煙田種群中，有3個沒有遺傳多樣性，另外3個種群核苷酸多樣性為0.000 69～0.006 61，昭通鎮雄(ZTZXS)和昆明宜良(KMYLS)種群核苷酸多樣性最高；在13個工廠繁育種群中，有9個種群沒有遺傳多樣性，保山騰沖(BSTCG)和麗江玉龍(LJYLG)種群具有較高的核苷酸多樣性，曲靖宣城(QJXWG)和紅河彌勒(HHMLG)種群核苷酸多樣性較低.整體上看，云南省主要煙區煙田和工廠繁育種群總體的遺傳多樣性偏低.

10種單倍型中，4個為共享單倍型，6個為獨有單倍型(圖1).煙田種群只有3種單倍型，均為共享單倍型，其中Hap6為煙田種群所獨有.工廠繁育種群有6種單倍型，其中3個為獨有單倍型(Hap2、Hap3、Hap7).煙田種群中楚雄永仁(CXYZS)、昆明宜良(KMYLS)、昭通鎮雄(ZTZXS)均有2種單倍型(Hap4和Hap5，Hap4和Hap6)，而同一州市的工廠繁育種群只有1種單倍型(Hap4).Hap4是11個種群的唯一單倍型，只有保山騰沖(BSTCG)、保山隆陽(BSLYG)和云南普洱(YNPEQ)種群中沒有出現.而保山騰沖(BSTCG)(Hap2、Hap3)和云南普洱(YNPEQ)(Hap8、Hap9、Hap10)2個種群中就有5種獨有單倍型，保山隆陽(BSLYG)和云南普洱(YNPEQ)種群共享Hap1.

從單倍型數量和頻率來看，Hap4數量最多，共有73個個體，占所有樣本的69.5%，在17個種群均有出現，包含了所有的煙田種群和多數工廠繁育種群.其中Hap4在煙田種群中出現26次，占所有煙田樣本的86.7%，在工廠繁育種群出現47次，占所有工廠繁育樣本72.3%.

單倍型網絡圖(圖1)和系統發育樹(圖2)的結果一致，大致分為5支，各分支差異較大.云南普洱和保山騰沖種群的單倍型出現在關系較遠的兩個分支上，保山2個工廠繁育種群的單倍型均與其它工廠繁育種群的單倍型親緣關系較遠.除保山外，其他煙田和工廠繁育種群單倍型差異較小.

圖1 云南省主要煙區煙蚜繭蜂種群單倍型網絡圖 圖2 云南省主要煙區煙蚜繭蜂種群單倍型系統發育樹

2.2 煙蚜繭蜂的種群遺傳結構

云南多數種群之間成對的種群遺傳分化系數沒有顯著性差異，且僅有同一單倍型，沒有任何分化.除了保山、曲靖、紅河僅有工廠繁育種群外，其他地區同州市的煙田種群與工廠繁育種群之間基本沒有分化，具有相同的遺傳背景；不同區域工廠種群間分化較低，差異不顯著(p<0.05)；野生種群(YNPEQ)與保山隆陽種群(BSLYG)基本無分化(Fst=-0.079)，而與其他所有種群都有較大分化(Fst >0.5)，其中與11個種群(只有Hap4)的遺傳分化系數最大，為0.853 7；保山騰沖種群(BSTCG)與所有種群都有較大分化(Fst >0.5)，其中與11個種群(只有Hap4)的遺傳分化系數最大為0.789，與野生種群(YNPEQ)遺傳分化系數最小為0.582 5.

對6個州市的煙田和工廠繁育種群(楚雄、麗江、昆明、大理、文山、昭通)的AMOVA分子方差分析結果顯示，按照不同州市或煙田和工廠繁育種群不同類型劃分的群組之間均沒有顯著分化，表明變異主要來自單個種群內部.由此可見，云南不同地區的煙田和工廠繁育種群具有較為一致的遺傳背景.

圖3 云南省主要煙區煙蚜繭蜂種群間分化系數(Fst)

表3 云南省主要煙區煙蚜繭蜂種群不同分組的遺傳變異AMOVA分析

3 討論

煙蚜繭蜂大規模擴繁技術成熟，防治煙蚜效果顯著，但是種群衰退問題是限制煙蚜繭蜂應用的重要因素[26].隨著煙蚜繭蜂防治煙蚜技術的全國推廣，越來越多的繁蜂工廠被建立，明確人工釋放對煙田種群遺傳多樣性的影響，對煙蚜繭蜂保護利用以及合理復壯有重要意義.云南省是我國煙草的主要種植區，也是最早開展煙蚜繭蜂工廠化繁育以及大規模釋放和推廣應用的地區[20].了解云南工廠繁育和煙田種群的遺傳差異，可以為后續制訂科學有效的種群擴繁、復壯和田間釋放策略提供參考依據.

本研究中，半數煙田種群只有1種單倍型，對應地區的工廠繁育種群大部分也沒有遺傳多樣性，全部19個煙田和工廠繁育種群中有17個種群都共享單倍型Hap4，該單倍型是分布最廣泛的，在9個州市的工廠繁育種群均有出現，但是野生種群的所有單倍型均與Hap4相距較遠，變異較大.同時，分子方差分析結果也顯示煙田和工廠繁育種群遺傳分化低，遺傳背景相似，由此可見，煙田煙蚜繭蜂種群的遺傳多樣性與工廠繁育種群具有一致性，大規模釋放的煙蚜繭蜂在煙田能夠有效定殖，因此工廠繁育種群的遺傳多樣性反映了煙田種群的遺傳多樣性.不同州市間較低的遺傳分化表明，這9州市的蜂種可能具有同樣的來源，并且缺少野生親本的補充.保山的2個工廠繁育種群遺傳多樣性較高，且與云南普洱的野生種群共享Hap1，與Hap8、Hap9的關系較近，遺傳分化分析也顯示保山工廠繁育種群與普洱野生種群基本無分化，而與其他種群分化較高，因此，保山的蜂種可能經歷了來自野生種群的復壯，種群的遺傳多樣性得到提升.在以往的研究中，人工繁育種群的遺傳多樣性顯著低于野生種群的現象在凡納濱對蝦、光裸方格星蟲、蘭州鲇等水產動物養殖以及大熊貓等珍稀動物保護的研究中都有類似的報道[33-36]，但在天敵工廠化繁育及昆蟲研究中尚未有相關報道.在工廠化繁育中，由于缺少野生親本的補充，導致種群有效親本數量降低，近交幾率增加，遺傳多樣性喪失，種群衰退風險增大.而種群的衰退可能直接導致煙蚜繭蜂釋放到煙田后控害能力下降，達不到預期的生物防治效果.

本研究選取了4個線粒體蛋白質編碼基因作為分子標記，初步解析了云南省煙田煙蚜繭蜂種群遺傳多樣性的特點；總的來說，工廠繁育種群能夠在煙田有效定殖，但是長期工廠化繁育可能對煙田和工廠種群的遺傳多樣性造成了一定影響，因此云南省主要煙區在繁育和釋放煙蚜繭蜂進行生物防治時應注意及時補充野生親本對蜂種進行合理復壯，同時應該開展長期的遺傳多樣性監測，警惕可能存在的種群衰退的風險.線粒體基因具有進化速率較快、母系遺傳、同源性高且易于分析等特點，在解析物種的種群遺傳結構方面具有一定的優勢，但是線粒體基因由于其重要的功能往往受到較大的選擇壓力，在探究物種的適應性進化及其遺傳機制等方面作用不足，后續可使用基因組層次SNPs等高分辨力的分子標記進一步研究，在基因組水平更好地理解煙蚜繭蜂的種群分化格局和種群衰退的遺傳基礎等問題.此外，本研究中種群的樣本量較少，特別是缺少其他野生種群的樣本，因此不能確定大規模繁育和釋放對當地野生種群的影響，也不清楚云南省不同地區的野生種群分化程度如何，這需要后續進一步的取樣分析.