油菜素甾醇對溝葉結縷草長期培養愈傷組織生長和再生的影響

林恬逸 周 認 柴明良

(浙江大學農業與生物技術學院園藝系,浙江杭州 310058)

胚性愈傷組織是禾本科植物分子育種的重要材料,應用體細胞無性系變異技術是暖季型草坪草改良的有效途徑。利用愈傷組織進行突變體篩選的前提條件是建立長期維持再生頻率高的細胞培養系。在結縷草(Zoysia.japonicaSieb.et Zucc.)的研究中只有形態特征為黃色、緊實、非常疏松的愈傷組織類型才具有較高的再生頻率[1]。從長期維持的愈傷組織培養體系中獲得高頻率再生能力的愈傷組織具有重要的價值,能高效、持續、經濟地為植物生物技術研究提供材料[2-5]。

溝葉結縷草[Zoysiamatrella(L.)Merr.],又名馬尼拉草,為禾本科多年生暖季型草坪草,是我國自然分布的5個結縷草屬草種之一[6]。由于其具有質地細密、坪觀質量好、生長勢強、綠期長、傳播快、耐鹽、耐蔭性強和養分需求低等優點[7],在我國海南、廣東、臺灣等熱帶地區及長江以南等亞熱帶地區廣泛應用。溝葉結縷草主要通過根狀莖和匍匐莖進行營養繁殖,相較于傳統的雜交育種,溝葉結縷草主要利用體細胞無性系變異和基因工程等新的生物技術手段進行品種的選育[8]。盡管部分研究對結縷草屬植物離體培養和再生進行了報道[9-11],但利用營養器官誘導愈傷組織難度大、周期長,誘導獲得胚性愈傷組織效率低,在實際研究中培養具有高再生能力的可快速生長的結縷草胚性愈傷組織仍存在較大的困難[12]。經過多年的研究,浙江大學觀賞植物組織培養實驗室建立了一套高效的溝葉結縷草愈傷組織誘導、胚性愈傷組織分離及長期維持胚性愈傷組織的方法[13],為溝葉結縷草生物育種奠定了基礎。但研究發現,愈傷組織的長期繼代培養通常會導致其再生能力降低[14],而轉基因玉米(Zea maysLinn.)抗性愈傷組織再生的研究中發現,繼代4次時,分化率從80%降至20%[15];在蕪萍[Wolffia arrhiza(L.)Horkelexwimm]愈傷組織誘導中,利用二步法愈傷組織離體培養僅能維持約一年的時間[16];小麥(TriticumaestivumL.)幼胚愈傷組織隨著誘導和繼代間隔時間的延長,愈傷組織分化率迅速下降[17]。隨著培養時間的延長,繼代次數的增加,溝葉結縷草的胚性愈傷組織的再生率呈現下降趨勢,繼代6年、8年、10年的愈傷組織再生率約分別為80%、70%和40%[18-20]。在植物組織培養過程中,植物生長調節劑對促進離體植物組織的生長具有很好的效果[21],因此利用植物生長調節劑不斷優化完善長期離體的愈傷組織培養體系,對維持其高效的再生能力具有重要的意義。因此,許多研究通過添加不同濃度生長素[2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)]、脫落酸(abscisic acid,ABA)、酪蛋白氨基酸、脯氨酸、山梨醇和甘露醇等植物生長調節劑和添加劑,恢復并提高長期培養的禾本科植物如小米[Eleusine coracana(L.)Gaertn][22]、柳枝稷(PanicumvirgatumL.)[23]、玉米[24]等和其他具有經濟效益的植物如苜蓿(MedicagosativaL.)[25]、牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)[26]、草莓(FragariaananassaDuch.)[27]、火龍果(HylocereusundatusBritt.)[28]等植物愈傷組織的再生能力,以此建立愈傷組織長期維持并高效再生的培養體系。

油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)是一種調節植物發育和生理過程的類固醇激素,在細胞分裂、植物莖和根的伸長、光形態建成、生殖發育、葉片衰老、脅迫響應等方面有著重要作用[29]。目前,生長素[如2,4-D、IAA、NAA、吲哚丁酸(indole-3-butytric acid,IBA)等]和細胞分裂素[如6-芐基腺漂呤(6-benzyladenine,BA)、噻苯隆(thidiazuron,TDZ)、激動素(kinetin,KIN)、玉米素(zeatin,ZEA)等]是植物組織培養應用中最主要的兩類生長調節劑[30]。在前期對溝葉結縷草離體培養和再生體系構建和優化的過程中發現,生長素和細胞分裂素對促進愈傷組織生長和提高再生效率起到了關鍵作用[26,31]。而BR作為一類重要的植物激素,在植物組織培養和體細胞無性系變異中也發揮著重要功能。油菜素內酯(brassinolide,BL)、高油菜素內酯(homobrassinolide,HBL)和表油菜素內酯(epibrassinolide,EBL)是植物生理研究中應用最廣泛的3種油菜素甾醇類物質[32]。研究表明,外源BL能促進針葉樹和水稻(OryzasativaL.)的胚性組織的形成[33],促進甘蔗(Saccharumspp.)嫩芽的離體培養并提高其馴化成活率[34],促進花椰菜(Brassicaoleraceavar.boturytis L.)下胚軸不定芽再生[35],促進狐米草(Spartinapatens)[36]愈傷組織增殖、生長和再生。外源施用EBL能促進高叢藍莓(VacciniumcorymbosumL.Brigitta blue)[37]再生,對小麥[38]、水稻[39]愈傷組織細胞伸長和分裂也具有明顯的促進作用。

目前,BR對植物組織培養的研究主要集中在其對愈傷組織生長和再生的作用上,對BR參與愈傷組織生長和再生過程的生理變化及其對抗氧化系統的影響研究較少。因此,本研究以EBL為外源植物生長調節物質,探究不同濃度EBL對溝葉結縷草愈傷組織生長和再生的影響,研究其對抗氧化系統的作用機理,旨在選出最優EBL濃度,提高長期離體培養的愈傷組織生長及再生的效率,為優化溝葉結縷草繼代和再生體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為溝葉結縷草匍匐莖誘導的胚性愈傷組織,在浙江大學觀賞植物組培實驗室中繼代培養15年。以MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.15 g·L-1脯氨酸+40 g·L-1蔗糖+3.0 g·L-1植物凝膠(Phytagel)為繼代培養基,每4周繼代培養1次。

1.2 試驗方法

1.2.1 EBL對愈傷組織繼代生長的影響 以上述繼代培養基為基本培養基,分別添加不同濃度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50μmol·L-1)的EBL,以0 μmol·L-1EBL為對照。調節pH值至5.8,培養基在121℃下滅菌20 min,備用。選取直徑約3 mm旺盛生長的淡黃色顆粒狀的致密胚性愈傷組織作為外植體,每皿接種20(5×4)塊,稱量初始鮮重,每個濃度梯度設置5個生物學重復。在25±2℃的培養室暗培養4周后測定胚性愈傷組織的直徑(mm)和鮮重(g),計算直徑增長率、鮮重增長率,觀察記錄愈傷組織生長情況并統計褐化率[39]:

1.2.2 EBL對愈傷組織再生的影響 以再生培養基1/2MS+30 g·L-1蔗糖+3.0 g·L-1Phytagel為基本培養基,分別添加不同濃度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1)的EBL,以0 μmol·L-1EBL為對照,調節pH值至5.8,培養基在121℃下滅菌20 min,備用。愈傷組織在繼代培養基預培養2周后,選取直徑3 mm大小均勻、生長旺盛的愈傷組織,接種至再生培養瓶中,每瓶接種16(4×4)塊,每個濃度梯度設置5個生物學重復。在溫度25±2℃,光照16 h·d-1,光強約為40μmol·m-2·s-1的培養室中進行再生。6周后觀察記錄胚性愈傷組織的根、芽的生長情況,分別統計直徑、鮮重增長率、褐化率和再生率:

1.2.3 EBL對愈傷組織繼代和再生過程中生理的影響 分別取繼代培養4周的愈傷組織和再生培養6周的再生植株葉片0.1 g,每個處理重復3次。取樣后置于4℃預冷的研缽中,依次加入3mL 50mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.8,0.2 mmol·L-1EDTA,1%PVP)進行研磨,充分研磨后在4℃、12 000 r·min-1條件下離心20 min,回收上清液。用UV-2550型分光光度計(日本SHIMADZU公司)測定抗氧化酶活性等生理指標[40]。由于過氧化氫酶(catalase,CAT)活性在愈傷組織的測定中不穩定,不具備統計學意義,因此繼代培養的愈傷組織測定過氧化物酶(peroxidase,POD),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;再生植株葉片測定CAT、POD、SOD活性及MDA含量。CAT活性測定參照Liang等[41]的方法,POD活性測定采用愈創木酚法[42],SOD活性測定采用NBT(氮藍四唑)光還原法[43],MDA含量采用硫代巴比妥酸法[44]。

1.3 數據統計與分析

試驗結果均為3或5次重復的平均值,使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和Duncan’s多重比較(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EBL對溝葉結縷草愈傷組織生長的影響

溝葉結縷草愈傷組織在含不同濃度的EBL培養基中繼代生長4周后,其直徑、鮮重(表1)及生長狀況(圖1)在各處理間存在明顯差異。當EBL濃度為0.02μmol·L-1時,愈傷組織的直徑達到最大值(6.93 mm),直徑增長率為131.11%;當EBL濃度為0.20 μmol·L-1時,愈傷組織鮮重增長量最高,達到1.24 g,鮮重增長率是對照組的2.9倍;EBL濃度為0.50 μmol·L-1時愈傷組織鮮重增長率是對照組的1.7倍。0.20μmol·L-1濃度的EBL對促進愈傷組織鮮重增長明顯,但實際生長情況表明,0.20和0.50μmol·L-1EBL處理組的愈傷組織呈現明顯的白色水漬狀,愈傷組織明顯失去胚性(圖1-f、g)。而0.01和0.02 μmol·L-1EBL對鮮重的增長也有較好的促進作用,且愈傷組織胚性維持良好,在繼代過程中始終保持淡黃色、緊致的顆粒狀(圖1-c)。從愈傷組織的褐化率來看,當EBL濃度為0.01～0.20μmol·L-1時,愈傷組織褐化率均低于對照,當EBL濃度為0.5μmol·L-1時,愈傷組織的褐化率高達50.0%。綜上表明,適宜濃度的EBL能促進愈傷組織的生長,減少褐化發生,保持愈傷胚性和生長活性,0.02μmol·L-1EBL是促進愈傷組織生長的最佳濃度。

2.2 不同濃度EBL對溝葉結縷草愈傷組織再生的影響

不同濃度的EBL處理后,溝葉結縷草愈傷組織再生過程表現出明顯差異(表2、圖2)。再生6周后,所有濃度處理組的愈傷組織直徑增長率與對照組均無顯著差異。而從愈傷組織的鮮重增長率和再生率看,0.02μmol·L-1EBL處理組的鮮重增長率和再生率分別達到了對照組的1.1倍和2.1倍。0.05μmol·L-1EBL處理組的鮮重增長率僅次于0.02μmol·L-1EBL處理組,是對照組的1.11倍,但其再生率高于對照(圖2-d)。從愈傷組織的褐化程度看,再生培養6周后,0～1.00μmol·L-1EBL濃度處理組均有不同程度褐化,且不同組合之間褐化程度差異不顯著,只有在EBL濃度高達2.00μmol·L-1時,愈傷組織出現明顯褐化(圖2-i)。綜合分析,0.02μmol·L-1EBL處理能提升溝葉結縷草再生能力,更好地促進胚性愈傷組織的再生,而EBL濃度過高則抑制愈傷組織的再生。

2.3 不同濃度EBL對溝葉結縷草愈傷組織和再生植株生理的影響

2.3.1 不同濃度EBL對繼代過程中愈傷組織生理的影響 不同濃度EBL處理對溝葉結縷草愈傷組織繼代過程中POD、SOD活性和MDA含量有不同程度影響,但不同濃度的EBL處理對POD、SOD活性和MDA含量的影響的程度存在差異。由圖3-A可知,隨著EBL濃度的增加,POD活性表現出先下降后上升再下降的趨勢,0.01、0.02、0.05和0.10μmol·L-1處理組POD活性均顯著低于對照,說明低濃度EBL抑制POD活性,0.20μmol·L-1EBL處理組POD活性顯著高于對照組,是對照組的1.28倍,該濃度EBL處理對溝葉結縷草愈傷組織繼代過程中POD的活性具有促進作用。由圖3-B可知,當EBL濃度達到0.50μmol·L-1時SOD活性較對照顯著降低了76.76%,說明該濃度EBL對SOD活性有抑制作用;其余濃度處理組SOD活性與對照組差異不顯著,但整體隨EBL濃度增加呈先上升后下降的趨勢。由圖3-C可知,不同濃度EBL對MDA含量也有較大影響,EBL處理組均顯著低于對照組,其中0.02μmol·L-1EBL處理組MDA含量最低,較對照降低了42.78%。

表1 EBL對溝葉結縷草愈傷組織繼代生長的影響Table1 Effects of EBL on the growth of embryogenic callus in Z.matrella

表2 EBL對溝葉結縷草愈傷組織再生的影響Table2 Effects of EBL on the growth of embryogenic callus in Z.matrella

綜合分析,在愈傷組織生長過程中低濃度的EBL能降低愈傷組織POD活性,EBL高于一定濃度后能顯著增加愈傷組織的POD活性,而高濃度的EBL對SOD活性具有抑制作用。EBL處理可降低愈傷組織MDA含量,0.02μmol·L-1EBL作用最強。

2.3.2 不同濃度EBL對再生植株生理的影響 不同濃度EBL處理對溝葉結縷草愈傷組織再生過程中CAT、POD、SOD活性和MDA含量有不同程度影響(圖4)。0.20μmol·L-1EBL處理組未獲得再生植株,以愈傷組織進行生理測定,與再生植株葉片生理不能在同一水平進行比較,因此在結果分析中不包含此項數據。不同濃度EBL處理組的CAT活性均顯著高于對照組,其中1.00μmol·L-1EBL處理組CAT活性最高,是對照組的5.96倍;相對其他濃度處理組,0.05μmol·L-1EBL處理組CAT活性最低,是對照組的3.70倍。POD活性與CAT一樣均有不同程度的增加。0.50 μmol·L-1EBL處理組POD活性最高,是對照組的2.11倍。SOD活性則隨著EBL濃度增加表現出先上升后下降的趨勢,0.10μmol·L-1EBL處理組SOD活性顯著高于對照組,其余濃度處理組與對照組差異不顯著。因此,不同濃度的EBL可能通過影響不同的抗氧化反應從而對植物再生產生不同影響。再生植株MDA含量變化趨勢與愈傷組織基本相同。不同濃度EBL處理組的MDA含量均低于對照組,0.02、0.05和2.00μmol·L-1EBL處理組與對照差異顯著,其中0.02μmol·L-1處理組MDA含量最低,比對照降低了30.15%。綜合分析表明,EBL對愈傷組織再生過程中CAT、POD、SOD活性具有不同程度的促進作用,表明EBL可通過抗氧化反應體系調控溝葉結縷草愈傷組織再生。

3 討論

BR是具有廣泛生物活性的一類植物激素,研究表明,BR通過與生長素、赤霉素和細胞分裂素等植物激素的協調作用對植物生長進行調控,通過刺激植物的伸長、細胞分裂和維管發育而對植物產生生理影響[45]。在各種生物測定中,油菜素內酯的活性較生長素如IAA或NAA高10～1 000倍,或與生長素協同作用[46-47]。Pullman等[33]研究發現BR刺激體細胞胚胎發生,顯著提高了針葉樹和水稻的誘導率;Chavan等[34]發現BR可能直接或通過刺激生長素和細胞分裂素來促進甘蔗生長;Sasaki[35]在油菜素內酯增加花椰菜下胚軸不定芽產生的研究中發現,當BR與細胞分裂素同時作用時,再生率顯著提高,表明BR在誘導分化過程中的部分作用是增加細胞分裂素的效力。浙江大學觀賞植物組培實驗室前期研究發現施加適宜濃度的細胞分裂素能促進溝葉結縷草愈傷組織的生長、再生,并加強抗氧化酶的活性。本試驗結果表明,0.02 μmol·L-1EBL處理的溝葉結縷草愈傷組織生長及再生能力得到明顯提升,因此,BR對溝葉結縷草愈傷組織的生長和再生有顯著的促進作用,可能通過與細胞分裂素或生長素等其他激素途徑的協同作用從而影響其生長和再生。而0.02μmol·L-1EBL處理在試驗期內未觀察到肉眼可見的再生芽,可能由于經過長期繼代培養的愈傷組織通常再生能力下降,同時形成再生植株需要的時間較長。雖存在上述愈傷組織的特性及肉眼觀察帶來的誤差,但EBL處理的總體趨勢是低濃度EBL促進愈傷組織再生,高濃度EBL的促進作用下降。

植物體在長期的進化過程中形成了一套抗氧化酶系統來清除體內的活性氧(reactive oxygen species,ROS),維持植物體內正常的新陳代謝,植物體內抗氧化系統主要由CAT、POD和SOD等組成。雖然促進ROS氧化還原調節植物生長和脅迫耐受性的確切機制仍有待闡明,但是越來越多的證據支持ROS是激素信號傳導中至關重要的第二信使,該信號可協調調節植物的發育和脅迫耐受性[48]。研究表明BR能誘導ROS的產生。因此,外源EBL的作用能夠刺激愈傷組織中ROS產生,從而激活植物體內抗氧化酶活性。這與本研究EBL處理再生過程中抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性增強的結果一致。多項研究也表明,植物體細胞胚胎發生過程與抗氧化酶系統有直接的聯系,SOD活性升高對早期胚胎發育和胚性細胞分化具有促進作用,隨著體細胞胚胎發生的進程,SOD活性表現出先上升后下降并趨于穩定的現象,而較低水平的POD活性有利于細胞的分裂和增殖,當胚性細胞大量形成后,POD活性升高[49-51]。本研究中,繼代過程各EBL處理組POD活性降低,SOD活性無顯著變化,但在較低濃度EBL處理下整體呈上升趨勢,有利于愈傷組織細胞分裂和增殖,再生過程中EBL處理組CAT、POD、SOD活性均升高,有效促進了溝葉結縷草胚性細胞的分化和再生。而SOD活性升高但差異不顯著,可能是由于再生6周后,細胞生長進入適應期,SOD活性逐漸趨于穩定。

MDA是膜脂過氧化的最終分解產物,其含量是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標,激活抗氧化系統有助于植物去除體內過量的ROS和抑制脂質過氧化[52]。本研究中,EBL處理溝葉結縷草愈傷組織繼代和再生過程MDA含量均降低,可能是由于EBL通過BR途徑激活了植物體內的抗氧化系統,抑制脂質過氧化反應發生,從而抑制了MDA的產生和積累。在繼代和再生過程中,0.02μmol·L-1EBL處理組MDA含量最低,說明該濃度下EBL對抗氧化系統活性作用最強。本研究為探究BR調控溝葉結縷草體細胞胚胎發生過程中生理機制和分子機理提供基礎資料,為進一步優化溝葉結縷草組織培養體系及對溝葉結縷草愈傷組織生長與再生過程中關鍵酶及其相關的基因研究提供了理論依據。

4 結論

本研究結果表明,BR對溝葉結縷草愈傷組織的生長和再生有明顯的促進作用,0.02μmol·L-1EBL顯著提升愈傷組織的再生率,可用于改善體細胞無性系變異的擴繁體系,具有廣泛的應用前景。同時,EBL可能通過BR及其他相關激素途徑激活愈傷組織的抗氧化系統的響應,加強繼代和再生過程中的抗氧化反應,從而調控體細胞胚胎發生過程中的生理生化進程。