檸檬酸和乙酸對致腐假單胞菌的抗生物被膜研究

姜春新 王雅瑩 洪小利 李春柳 張 蕾 朱軍莉

(浙江工商大學食品與生物工程學院/浙江省食品安全重點實驗室,浙江 杭州 310018)

假單胞菌(Pseudomonasspp)是一類革蘭氏陰性菌,嚴格好氧菌,其環境適應能力強,在有氧條件下分解食品中蛋白質和脂肪的能力強,是影響冷鏈物流的重要致腐微生物。其中,熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)作為嗜冷菌,是引起低溫水產品、奶類等食品低溫腐敗變質的主要細菌之一[1];隆德假單胞菌(Pseudomonaslundensis)也參與冷藏肉類和奶類等動物性食品腐敗進程[2]。生物被膜是細菌為適應生存環境,附著于活性或惰性實體表面,被細菌胞外基質包裹的結構性微生物群落[3]。生物被膜及其胞外分泌物能夠為細菌提供特殊的微環境,使其免受溫度、抗生素、pH等外部環境因素的侵害,降低多種消毒措施和防腐劑對其的不良影響[4]。假單胞菌在低溫下更易形成生物被膜,從而很難從食品接觸面和加工設備中清除,導致食品加工環境中的交叉污染[5-6]。

乙酸(acetic acid,AA)、檸檬酸(citric acid,CA)等有機酸作為食品的酸化劑和抑菌劑,被美國食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)評價為一般公認安全(gernerally recognized as safe,GRAS)添加劑。研究表明,有機酸對致瀉性的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌等多種食源性致病菌表現良好的抑菌性,抑菌活性取決于細菌胞內酸根離子的聚集,而細菌胞內外pH梯度及胞外酸根離子濃度影響聚集程度[7]。此外,有機酸還可抑制細菌生物被膜的形成[8],其中低濃度CA可抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的生成[9],苯乳酸能有效減少多糖分泌而抑制糞腸球菌生物被膜的形成[10],兒茶酸可降低副豬嗜血桿菌生物被膜的形成能力[11]。目前有機酸對食品微生物控制研究多集中在抑菌活性方面[12-13],而有關其對微生物生物被膜影響的報道較少。鑒于此,本研究以食品致腐熒光假單胞菌和隆德假單胞菌為試驗對象,分析CA和AA對假單胞菌生物被膜形成、粘附和致腐性的影響,旨在為有機酸在生鮮食品保鮮中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

熒光假單胞菌PF07和隆德假單胞菌PS28分別分離自冷藏腐敗的大黃魚和牛肉,細菌經純化和鑒定后保存于浙江工商大學食品微生物安全與控制實驗室,其16S rDNA的NCBI登錄號分別為KU173832和MK041549。將本實驗室-80℃保存的2株甘油菌接種于LB(luria-bertani)培養基,28℃連續過夜活化后,待用。

CA和AA(均為分析純≥99.5%),購自國藥集團化學試劑有限公司;SYT09和PI熒光染料購自美國Thermo Fisher Scientific公司;LB肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)和營養瓊脂,購自青島海博生物技術有限公司;冰鮮養殖大黃魚購自杭州下沙高沙農貿市場。

1.2 主要儀器與設備

VICTOR X酶標儀,美國Perkin Elmer公司;UV-1800紫外分光光度計,日本SHIMADZU公司;Zeiss LSM 710共聚焦掃描顯微鏡,德國蔡氏公司;CX22光學顯微鏡,日本OLIPUS公司;SPX-150B-Z生化培養箱,上海博訊公司;3-18K離心機,美國SIGMA公司;KDN-103F自動定氮儀,上海纖檢儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 假單胞菌最小抑制濃度(minimuminhibitory concentration,MIC)測定 將CA和AA分別用滅菌水配制成濃度為100 mg·mL-1的溶液,采用二倍稀釋法測定MIC[14]。將過夜活化的熒光假單胞菌和隆德假單胞菌菌液以104～105CFU·mL-1接種于含有1.7～2.2 mg·mL-1CA及0.7～1.2 mg·mL-1AA的TSB培養基,28℃培養,每4 h取樣測定600 nm波長處的吸光度值(OD600),繪制生長曲線,確定MIC。

1.3.2 生物被膜和胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)含量測定 將含有亞抑菌濃度有機酸,即1/4 MIC、1/2 MIC CA(0.55 mg·mL-1和1.10 mg·mL-1)和AA(0.25 mg·mL-1和0.50 mg·mL-1)的熒光假單胞菌和隆德假單胞菌菌液分別添加至96孔板中,每孔200μL,以未添加有機酸的TSB菌液為對照,28℃靜置培養24 h后,采用結晶紫染色法測定生物被膜含量[15]。具體方法:每孔用250μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)輕輕漂洗3次,去除孔板中菌液,干燥,然后加入200μL 0.2%結晶紫溶液染色15 min,用PBS清洗后干燥,最后加入200 μL 75%乙醇,采用酶標儀測量590 nm波長處的吸光度值(OD590)。

取制備的含有亞抑菌濃度有機酸的熒光假單胞菌和隆德假單胞菌菌液分別添加至6孔板中,每孔9 mL,28℃靜置培養24 h,去浮游菌后,用PBS重懸菌體,50 kHz超聲5min后,80℃加熱30min提取。取上清采用苯酚-硫酸法測定EPS含量。

1.3.3 細菌薄膜觀察 取1.3.2制備的TSB對照和含亞抑菌濃度有機酸的熒光假單胞菌和隆德假單胞菌菌液分別添加至6孔板,每孔9 mL,28℃靜置培養24 h后,用無菌牙簽挑破薄膜并透光進行薄膜定性觀察。

1.3.4 細菌粘附性觀察 取1.3.2制備的對照和含亞抑菌濃度有機酸的熒光假單胞菌和隆德假單胞菌菌液分別添加至24孔板(每孔含有1片玻璃片),每孔2 mL,28℃培養24 h后取出玻片,用0.85%生理鹽水洗脫3次后,將玻片上粘附的被膜菌用0.1%結晶紫染色1 min,水洗干燥后在光學顯微鏡下觀察。

1.3.5 共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察生物被膜 取1.3.2制備的對照和含亞抑菌濃度有機酸的熒光假單胞菌菌液分別添加至培養小皿,每小皿3 mL,28℃靜置培養24 h,SYTO9-PI染液處理后,CLSM觀察生物被膜結構,其中生物被膜活菌染上SYTO9為綠色和死菌染上PI為紅色[5]。

1.3.6 細菌運動性測定 參考Li等[6]的方法。在LB肉湯中分別添加0.5%和0.3%瓊脂配制成蜂擁培養基和泳動瓊脂培養基,2種培養基滅菌后冷卻至50℃左右,分別加入1/4 MIC、1/2 MIC的CA和AA,傾注平板。待瓊脂平板凝固干燥后,將5μL過夜活化的熒光假單胞菌和隆德假單胞菌菌液分別接種至平板中心,28℃靜置培養,每隔12 h測量細菌的運動直徑。

1.3.7 細菌蛋白酶活性測定 參考葛陽楊等[16]的方法提取無菌魚汁,將2種假單胞菌以1‰接種量接種于含1/4 MIC、1/2 MIC CA和AA的魚汁培養基中,4℃冷藏6 d,采用福林酚法測定魚汁中假單胞菌的蛋白酶活性[16]。

1.4 數據處理

抑菌活性和生物被膜等試驗均設3或5個重復,采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件進行數據處理和作圖,并利用SPSS 19.0軟件的AVOVA進行方差分析,P＜0.05表示有統計學顯著性差異,結果為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸和乙酸對假單胞菌生長的影響

有機酸對大多數微生物具有抑菌作用,其抑菌活性主要受疏水性、未離解酸水平和pH值等因素的影響[7]。由圖1可知,對照組熒光假單胞菌在培養4 h后進入對數生長期,細菌數量增長明顯,培養28 h后進入穩定期。CA濃度高于1.7 mg·mL-1時明顯抑制熒光假單胞菌的生長,而濃度高于2.1 mg·mL-1時菌體基本不生長;AA濃度高于0.7 mg·mL-1時熒光假單胞菌生長受到抑制,濃度高于1.0 mg·mL-1時菌體基本不生長。因此,CA和AA對熒光假單胞菌的MIC分別為2.1和1.0 mg·mL-1。試驗過程中發現,2種有機酸對隆德假單胞菌的MIC也為2.1和1.0 mg·mL-1,均具有濃度依賴性(結果未顯示),其中AA表現更強的抑菌活性。進一步發現1/2 MIC和1/4 MIC的CA和AA不影響2種假單胞菌的生長。

2.2 檸檬酸和乙酸對假單胞菌生物被膜形成的影響

亞抑菌濃度CA和AA對2種假單胞菌生物被膜形成的影響結果如圖2所示。經結晶紫染色發現,熒光假單胞菌和隆德假單胞菌培養24 h的生物被膜量分別達到2.34和2.40(OD590),提示兩分離株為強生物被膜形成菌。與對照組相比,2種有機酸濃度為1/4 MIC和1/2 MIC時,熒光假單胞菌生物被膜量分別減少了25.30%和47.11%(CA)、33.45%和53.00%(AA),而隆德假單胞菌的生物被膜量分別減少了25.29%和43.95%(CA)、33.14%和52.19%(AA)。表明AA和CA在亞抑菌濃度下,能顯著抑制2種假單胞菌生物被膜的形成(P＜0.05)。

2.3 檸檬酸和乙酸對假單胞菌胞外多糖分泌的影響

EPS是生物被膜胞外分泌物的重要組分,具有填補細胞間隙、聚集細胞等作用。細菌EPS大量聚集使生物被膜加厚,可增強抵御消毒劑、抗生素等不良因子的破壞能力[3]。由圖3可知,經24 h培養后隆德假單胞菌較熒光假單胞菌分泌更多的EPS,亞抑菌濃度CA和AA處理后菌體的EPS分泌量顯著降低(P＜0.05),1/4MIC、1/2MIC CA處理下熒光假單胞菌的EPS分泌量分別降低了15.57%和44.19%,1/4MIC、1/2MIC AA處理導致EPS分泌量分別降低了39.65%和54.43%;而隆德假單胞菌在1/4MIC、1/2MIC CA作用下EPS分泌量分別降低了22.69%和42.67%,在1/4MIC、1/2MIC AA作用下EPS分泌量分別降低了39.51%和57.85%。此外,亞抑菌濃度下,AA比CA具有更強的EPS抑制活性。

2.4 檸檬酸和乙酸對氣液間薄膜形成的影響

薄膜是指細菌在靜置培養時氣體與液體交界面形成的一類生物被膜,由大量菌體和胞外聚合物組成。由圖4可知,對照組28℃培養24 h后菌液上層覆蓋著一層不透明、致密的薄膜,用牙簽劃至薄膜表面具有粘稠、不易破裂的特點,且薄膜易粘在牙簽上被帶動,提示假單胞菌分泌聚合物的能力強。添加1/2 MIC CA和AA后薄膜變得較脆,易劃破,且AA處理下形成的薄膜更脆。2種有機酸在1/4 MIC濃度作用下薄膜形成質感略有影響,經24 h培養后的薄膜仍較粘稠。

2.5 假單胞菌粘附性和生物被膜結構觀察

采用顯微鏡觀察熒光假單胞菌和隆德假單胞菌的粘附和生物被膜結構,結果如圖5所示。對照組熒光假單胞菌和隆德假單胞菌的粘附菌量較多,且聚集成團塊,其中隆德假單胞菌菌體染色較深。而亞抑菌濃度CA和AA處理后,對玻璃片上菌體形態無影響,但粘附量明顯減少,尤其是1/2 MIC CA和AA處理下菌體分布稀疏,粘附菌減少約10倍。CLSM觀察發現培養24 h后的熒光假單胞菌生物被膜較致密,厚度約50 μm,SYTO9綠色熒光強度明亮,而亞抑菌濃度2種有機酸處理下熒光假單胞綠色熒光信號下降,生物被膜變薄,其中在1/2 MIC CA和AA作用下生物被膜厚度分別減少至9.8μm和10.2μm。且處理組生物被膜中PI紅色熒光信號增強,表現出濃度依賴性,尤其是AA處理組。結果提示CA和AA分子能滲透至復雜的生物被膜內部,導致被膜菌體的死亡。相對于CA,AA處理后熒光假單胞菌被膜厚度無顯著差異,然而被膜菌分布更稀疏,死細胞明顯增多。

2.7 檸檬酸和乙酸對假單胞菌運動性的影響

細菌生物被膜的形成與其運動性密切相關,其中菌體表面的鞭毛使細菌接觸介質表面,促進生物被膜初期形成[17]。圖6顯示了亞抑菌濃度CA和AA對致腐性假單胞菌蜂擁性和泳動性的影響。熒光假單胞菌在2種運動瓊脂上形成明顯的蜂擁圈和泳動圈,經1/4 MIC CA處理24 h的熒光假單胞菌蜂擁圈減少53.2%。培養36 h后熒光假單胞菌對照組泳動直徑為7.4 cm,經1/4 MIC CA處理的熒光假單胞菌胞菌泳動圈減少12.2%。而1/2MIC CA、1/4MIC AA及1/2MIC AA處理后的熒光假單胞菌均未出現運動性。試驗過程中發現,隆德假單胞菌與熒光假單胞菌表現出相似的運動性。結果表明,CA和AA對2種假單胞菌鞭毛的運動性減弱,尤其是AA。

2.8 檸檬酸和乙酸對假單胞菌蛋白酶活性的影響

某些假單胞菌是冷藏牛肉和海鮮等富含蛋白質食品的特定腐敗菌,其致腐性與其高蛋白酶活性有關[18]。蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱。由圖7可知,2種假單胞菌均能分泌具有較高活性的蛋白酶,其中隆德假單胞菌分泌蛋白酶的活性更高。亞抑菌濃度CA和AA的添加顯著降低了2種假單胞菌分泌的蛋白酶活性(P＜0.05)。冷藏6 d后,1/4MIC、1/2MIC CA和AA處理下熒光假單胞菌的蛋白酶活性分別降低25.13%和26.53%(CA)、28.43%和29.03%(AA),隆德假單胞菌的蛋白酶活性分別降低22.21%和26.60%(CA)、31.90%和34.10%(AA),其中AA抑制蛋白酶活性效果更強。

3 討論

假單胞菌屬是冷藏生鮮動物性產品和水產品中的優勢腐敗菌[19],且為強生物被膜生成菌。本研究發現,CA和AA對2種致腐假單胞菌均有相似的抑制活性,CA和AA的MIC分別為2.1和1.0mg·mL-1,已報道乳酸對陰溝腸桿菌的MIC為5 mg·mL-1[10]。大多數微生物對有機酸都比較敏感,這與弱酸比強酸更容易擴散至菌體細胞膜有關,未解離的有機酸分子具有親脂性,迅速進入細胞膜后會降低細胞周質和胞內pH值,解離細胞內部成分,破壞細菌的生理功能。相對于CA,AA抑菌效果更好,可能是因為AA的解離常數比CA高,解離H+的速度更快,使環境的pH值更低[7]。

生物被膜的形成增強了食品中致病菌和腐敗菌細胞對環境消毒劑和抗生素的抵抗能力,會導致持續性污染[4]。本研究結果表明,亞抑菌濃度CA和AA均能顯著抑制生物被膜形成、EPS分泌、粘附性及薄膜形成,并表現出濃度依賴性。Amrutha等[20]也報道了AA、CA和乳酸可抑制新鮮果蔬中大腸桿菌和沙門氏菌生物被膜的形成。在0.5%和1%乙酸作用下銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生物被膜完全被抑制[21]。相對于CA,AA對2種假單胞菌生物被膜抑制作用更強,CLSM觀察也證實有機酸不僅降低了被膜的厚度和致密性,而且還能促進被膜菌的死亡。EPS是由菌體分泌的多糖基質、蛋白質、核酸等形成的具有高度組織化三維結構的胞外聚合物。本研究結果發現2種有機酸分子均能抑制EPS分泌量,從而影響了氣液交界面中薄膜的特性,酸根離子還可進入復雜EPS內部,促進菌體死亡。

菌體運動性對生物被膜形成初期的微菌落及其發展具有重要作用,細菌依靠鞭毛粘附在物體表面,并通過鞭毛在表面的游動使膜不斷變厚。本研究表明,亞抑菌濃度的CA和AA對熒光假單胞菌運動性的抑制效果明顯,且AA作用下假單胞菌運動性微弱。相似地,鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)在0.2%肉桂酸、0.6%乳酸和0.4%丙酸作用下能顯著減少運動性[22]。Minamino等[23]報道菌體在弱酸存在條件下,pH值由7.0向5.0適應過程中表現急劇降低泳動速度,細胞內質子濃度的增加導致大腸桿菌和沙門氏菌運動能力喪失。液相環境中pH值變化還可直接影響菌體的表面電荷特性,從而改變其在載體表面附著的動力學過程。因此,推測可能是CA和AA導致假單胞菌細胞內外質子濃度增加,鞭毛轉速降低,菌體運動性下降[19],從而干擾早期粘附和菌落聚集,抑制生物被膜的形成。

胞外蛋白酶活性是評價高蛋白食品中腐敗菌致腐能力的重要指標[1]。亞抑菌濃度AA和CA顯著降低了2種假單胞菌的蛋白酶活性。可能是質子化弱酸擴散入細胞內,在細胞質中解離,降低了酸敏感的酶活性[24]。多數細菌為了生存會啟動酸應激應答恢復胞內pH穩定[25],如有研究報道弱有機酸降低了伯氏疏螺旋菌(Borreliaburgdorferi)細胞質pH值,從而引起酸性應激反應及RpoN和RpoS依賴性基因表達,提高環境耐受性[26]。前期研究表明,食品腐敗菌生物被膜形成和致腐能力與群體感應調控密切相關[27-28],然而其分子調控機制仍有待進一步研究。

4 結論

本研究結果表明,CA和AA在1/4 MIC和1/2 MIC亞抑菌濃度下能有效抑制2種致腐假單胞菌生物被膜形成,降低被膜厚度,其與胞外多糖分泌和運動性下降密切相關,且能降低假單胞菌酶蛋白酶活性。本研究為有機酸應用于生鮮食品的貯藏保鮮提供了依據,對延緩食品腐敗及保證食品安全具有重要意義。后續研究將進一步探究有機酸對假單胞菌sigma因子和群體感應的調控機制。