水稻近等基因導入系芽期抗旱性鑒定及抗旱指標篩選

李其勇 朱從樺 李星月 向運佳 楊曉蓉 符慧娟 張 鴻

(四川省農業科學院植物保護研究所/農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室,四川成都 610066)

水稻栽培對水資源需求量大,其用水量占農業用水量超過65%[1]。而干旱是世界范圍內主要的自然災害,并呈現日益加重的趨勢[2],水稻生產對水分的需求與水資源短缺矛盾逐年加劇。在水稻芽期、苗期、分蘗期、拔節期、孕穗期、成熟期等各生育期受到干旱脅迫,對種子萌發、根芽生長、出苗、孕穗、光合生理、產量等有諸多不利影響[3-7],同時,不同生育階段干旱脅迫對稻米品質影響明顯[8]。為有效應對干旱威脅,開展水稻節水抗旱栽培研究變得尤為重要,而建立科學高效的抗旱鑒定方法,篩選優質抗旱育種材料育成耐旱品種,并進一步篩選具備廣適性優質抗旱水稻品種,是解決干旱災害的有效途徑。

近年來,研究者針對水稻芽期、苗期、穗期、成熟期等主要生育期篩選了一批抗旱鑒定指標,包括萌發脅迫指數、苗期反復干旱成活率、抗旱系數、抗旱指數等[9-12]。在苗期、本田期進行抗旱鑒定易受環境影響,耗時長、工作量大、指標測定復雜,而芽期鑒定較為方便快捷、條件可控、短時內可進行大批量鑒定,因此針對芽期抗旱鑒定的研究較多。前人利用相關性分析、主成分分析、隸屬函數綜合分析等方法提出了較多的鑒定指標,如相對胚根長、相對芽長、相對芽干重、相對發芽率、儲藏物質轉運速率、胚芽鞘長、根系活力和β-淀粉酶活力等,但不同研究者提出的鑒定指標并不完全相同[6,9,13-15]。由于水稻抗旱性是多基因決定的數量性狀,受環境影響變化復雜,導致目前抗旱性鑒定方法、指標并不統一。利用多種材料繼續開展抗旱指標篩選,獲得一批簡單易測、適用性廣、抗旱性預測效果準確的指標顯得十分必要。以往的研究多采用水稻品種、品系、野生稻、雜草稻等材料[11,16-19],而采用水稻近等基因導入系進行研究的較少,水稻近等基因導入系之間僅有少量基因差異,在遺傳背景相近的情況下,便于比較個別性狀差異,對單一性狀鑒定更為精細,避免大量遺傳背景信號給性狀鑒定帶來干擾,有利于針對目的性狀的篩選。因此本研究以近等基因導入系為材料,利用聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG-6000)在芽期進行種子萌發水分脅迫處理,比較近等基因導入系芽期對水分脅迫響應的差異,并通過綜合評價,篩選水稻芽期抗旱性鑒定指標,同時篩選具有較強抗旱性的材料,旨在為水稻抗旱性鑒定及應用抗旱材料改良品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以優質秈稻保持系川香29B為輪回親本,從全球水稻分子育種計劃的核心種質中選擇110個材料作供體親本,每個BC1F1選擇25個以上的單株與輪回親本回交,連續回交至BC3F1,然后自交。每個供體親本保證有25個左右的BC3F2群體,共構建完成3 300份BC3F2材料。在抗旱性初步鑒定的基礎上,選擇其中5份優異川香29B近等基因導入系(Chuanxiang 29B Near Isogenic Introgression Lines,簡稱川香29BNIILs)為研究對象,以川香29B為對照(表1)。

表1 川香29BNIILs名稱與代號Table1 Name and code of Chuanxiang 29BNIILs

1.2 試驗設計

試驗于2018年4月在四川省農業科學植物保護研究所恒溫光照培養室進行。采用PEG-6000溶液作為干旱脅迫介質,其溶液濃度按質量體積比配制(m/v),共設置4個濃度:5%、10%、15%、20%,以蒸餾水為對照,分別用T5、T10、T15、T20、CK表示。

6份參試材料分別挑選均勻飽滿種子各約1 000粒,用75%酒精表面消毒45 s后用蒸餾水潤洗3次,再加蒸餾水(淹沒種子)于28℃恒溫培養室中浸種24 h,然后用蒸餾水潤洗,置于底部鋪雙層濾紙、直徑90 mm的培養皿內,28℃催芽。待種子露白后,取出用濾紙吸干表面水分,取萌動一致的種子均勻擺進底部鋪雙層濾紙、直徑90 mm的培養皿中,每皿50粒,每皿分別加入10 mL相應濃度PEG-6000處理液,對照加入10 mL蒸餾水,每處理3次重復。蓋上培養皿蓋置于恒溫光照培養室中發芽,溫度28℃,光照周期8 h/16 h(光照/黑暗),光照強度200μmol·m-2·s-1。每天觀察培養皿內液體的變化并酌量添加蒸餾水,保持培養皿液體恒定,共處理10 d。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 萌發指標 發芽標準為胚根突破種皮1 mm、胚芽為種子長度1/2,每日定時測定發芽種子數。根據公式計算發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、種子萌發指數、萌發抗旱系數、根芽比、儲藏物質轉化率和種子萌發幼苗相對含水量:

式中,DG為逐日發芽種子數,DT為相應DG的發芽天數,計數至第8天。

式中,nd2、nd4、nd6、nd8分別為第2、第4、第6、第8天的種子萌發率,1.00、0.75、0.50、0.25分別為相應萌發天數所賦予的權重系數。

根芽性狀:處理后第8天在各培養皿內隨機選取20顆已發芽的種子,計量各種子的芽長、根長、根數,并分根、芽、剩余種子三部分分別稱量鮮重,分裝后于烘箱內105℃殺青0.5 h,80℃烘至恒重后稱量干重。

1.3.2 參數計算 除萌發抗旱系數外,根據公式計算各指標抗旱系數(drought coefficient,DC),發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、根芽比、芽長、根長、根數、芽干重、根干重、剩余種子干重、儲藏物質轉化率、幼苗相對含水量均以DC進行分析:

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2007進行數據整理,采用DPS14.05軟件進行方差分析、相關性分析、隸屬函數綜合分析等。

隸屬函數綜合分析法是一種較好的抗旱性鑒定指標綜合分析方法。采用模糊數學隸屬函數法,先計算參試品種各指標的隸屬值,通過標準差系數歸一化處理得到各性狀的權重,再以每個品種各性狀隸屬值與權重乘積的累加得到各品種的隸屬綜合值(comprehensive value ofmembership,CVM),最后依據CVM對各品種的抗旱性進行評價。

數據標準化處理公式:

式中,Xj表示第j個指標值,Xmin表示第j個指標的最小值,Xmax表示第j個指標的最大值。如某項指標與抗旱性為正相關,則采用公式(11)計算;如某項指標與抗旱性為負相關,則采用公式(12)計算。計算各品種(材料)各指標的隸屬值。采用標準差系數賦予權重法計算權重系數Wj:

式中,rj表示第j個指標的變異系數。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫對水稻種子萌發的影響

2.1.1 對水稻種子萌發相關指標的影響 由表2可知,除水分處理對發芽率抗旱系數無顯著影響外,水分處理和材料對發芽勢抗旱系數、發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數和萌發抗旱系數的影響達到極顯著水平,發芽勢抗旱系數、活力指數抗旱系數受水分處理和材料互作的影響達極顯著水平。對于水分處理來說,T5、T10的發芽勢抗旱系數、發芽率抗旱系數、發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數和萌發抗旱系數在處理間無顯著差異;T15、T20的發芽勢抗旱系數、發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數和萌發抗旱系數均隨水分脅迫加重而顯著降低。表明輕度水分脅迫對水稻種子萌發影響較小,PEG-6000處理濃度大于15%時才顯著抑制種子萌發,并且發芽率抗旱系數受水分脅迫影響弱于發芽勢抗旱系數、發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數、萌發抗旱系數。對于不同材料來說,T15、T20水分脅迫下,C2、C3的發芽勢抗旱系數、發芽指數抗旱系數和萌發抗旱系數低于其他4份材料;T20水分脅迫下,6份材料的發芽率抗旱系數、發芽指數抗旱系數無顯著差異。T15水分脅迫下,C3的活力指數抗旱系數最大,T20水分脅迫下,C2的活力指數抗旱系數最大。表明不同指標反映的信息并不相同。

2.1.2 對水稻種子根芽生長的影響 由表3可知,水分處理和材料均對種子萌發的芽長抗旱系數、根長抗旱系數、根數抗旱系數的影響達到顯著或極顯著水平,且水分處理和材料互作對根長抗旱系數影響極顯著。不同水分處理下芽長抗旱系數、根數抗旱系數平均值均隨水分脅迫加重而降低,且T20顯著低于T5、T10。對于芽長來說,各水分脅迫下,C2、C3的芽長抗旱系數均高于其他4份材料,表明水分脅迫對C2、C3的芽長抑制效應較輕。對于根長來說,水分脅迫總體增加了種子萌發的根長抗旱系數,且T15最高。各水分脅迫下,C2的根長抗旱系數均大于1,表現出增長效應,并且隨著水分脅迫加重而呈先上升后降低的趨勢。T5、T10水分脅迫下,各材料的根長抗旱系數在0.88～1.38之間,抑制效應較輕;T15水分脅迫下,C2、C3、C5、C6的根長抗旱系數在1.41～1.56之間,增長效應顯著高于C1、C4,且此水分脅迫對各材料的增長作用最為明顯;T20水分脅迫下,C2、C5、C6的根長抗旱系數在1.22～1.42之間,顯著高于C1、C3。對于根數來說,T5、T10水分脅迫下,C2、C3的根數抗旱系數較高,未受水分脅迫抑制;T15水分脅迫下,除C1的根數略高于CK外,其他材料的根數抗旱系數均受水分脅迫而降低,T20水分脅迫下,各材料的根數抗旱系數在0.75～0.94之間,根長均受水分脅迫影響而降低。

2.1.3 對水稻種子萌發物質變化指標的影響 由表4可知,水分處理和材料均對種子萌發的根干重抗旱系數、剩余種子干重抗旱系數、儲藏物質轉化率抗旱系數、幼苗相對含水量抗旱系數影響達顯著或極顯著水平,水分處理對芽干重抗旱系數影響顯著。對于芽干重來說,不同水分處理下材料平均抗旱系數隨著水分脅迫加重呈先升高后降低的趨勢,T5、T10、T15的芽干重平均抗旱系數在1.01～1.10之間;T20水分脅迫下,各材料抗旱系數在0.79～0.95之間,材料間無顯著差異。對于根干重來說,隨著水分脅迫加重其平均抗旱系數也呈先升高后降低的趨勢,T5、T10、T15的根干重平均抗旱系數在1.10～1.19之間;T20的根干重平均抗旱系數為0.99,但C2、C4、C5根干重抗旱系數均大于1。綜上可知,輕度水分脅迫下,各材料的芽干重、根干重較對照增加,表現出促進作用;此外,水分脅迫處理對根干重的促進作用強于芽干重,重度水分脅迫下對根干重抑制作用低于芽干重,這與芽長、根長的脅迫效應變化一致。對于剩余種子干重來說,隨著水分脅迫加重其平均抗旱系數增加,表明水分脅迫抑制了種子萌發的物質消耗與利用。對于儲藏物質轉化率來說,隨著水分脅迫加重其平均抗旱系數呈顯著降低趨勢,T5的平均抗旱系數為1.01,表現出微弱促進效應,T10、T15、T20的平均抗旱系數在0.76～0.99之間,表明水分脅迫抑制了種子物質的轉化利用,從而表現為具有較高剩余種子干重。對于根芽比來說,水分脅迫提高了種子萌發的根芽比。對于幼苗相對含水量來說,隨著水分脅迫加重其平均抗旱系數逐漸降低,T5的平均抗旱系數為1.01,T10、T15、T20的平均抗旱系數在0.89～0.94,均顯著低于T5。從物質變化來說,輕度水分脅迫刺激了種子萌發作用,促進了根、芽生長,重度水分脅迫抑制了種子萌發過程,降低了芽干重,降低了儲藏物質的轉化利用,并且減少了萌發幼苗的水分吸收積累作用,最終造成種子萌發受抑。此外,水分脅迫對芽的生長抑制效應強于根的生長,這也是種子萌發適應水分脅迫的一種方式。

表2 水分脅迫對近等基因導入系種子萌發相關指標抗旱系數的影響Table2 Effects of water stress on drought coefficient of seed germination related indexes of NIILs

表3 水分脅迫對近等基因導入系種子萌發根芽指標抗旱系數的影響Table3 Effects of water stress on drought coefficient of seed germination root and bud indexes of NIILs

2.2 水分脅迫下近等基因導入系種子萌發各指標相關性分析

由表5可知,發芽勢抗旱系數與發芽指數抗旱系數、萌發抗旱系數、芽干重抗旱系數的相關系數分別為0.781、0.699、0.499。發芽指數抗旱系數與萌發抗旱系數的相關系數為0.989,呈極顯著正相關,且二者與發芽勢抗旱系數、活力指數抗旱系數、芽干重抗旱系數、剩余種子干重抗旱系數、儲藏物質轉化率抗旱系數、幼苗相對含水量抗旱系數呈顯著或極顯著相關。活力指數抗旱系數與發芽指數抗旱系數、根長抗旱系數、芽長抗旱系數、根干重抗旱系數、剩余種子干重抗旱系數、儲藏物質轉化率抗旱系數和萌發抗旱系數呈顯著相關。根長抗旱系數除與活力指數抗旱系數呈極顯著正相關(0.735)外,與其他指標均無顯著相關性,而芽長抗旱系數與發芽率抗旱系數、活力指數抗旱系數、根數抗旱系數、根干重抗旱系數、剩余種子干重抗旱系數、儲藏物質轉化率抗旱系數、幼苗相對含水量抗旱系數呈顯著相關,可見,相比于根長抗旱系數,芽長抗旱系數與其他指標相關性更高。剩余種子干重抗旱系數與發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數、芽長抗旱系數、根數抗旱系數、儲藏物質轉化率、幼苗相對含水量抗旱系數和萌發抗旱系數均呈極顯著負相關。儲藏物質轉化率抗旱系數與發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數、芽長抗旱系數、根數抗旱系數、根干重抗旱系數、芽干重抗旱系數和萌發抗旱系數均呈顯著或極顯著正相關關系,與剩余種子干重抗旱系數呈極顯著負相關(-0.850)。綜上可知,與發芽勢抗旱系數顯著相關的指標多于發芽率抗旱系數,與芽長抗旱系數顯著相關的指

標多于根長。發芽指數抗旱系數、活力指數抗旱系數、萌發抗旱系數3個指標間相關性較強,且與這3個指標顯著相關的指標較為一致。儲藏物質轉化率抗旱系數與8個指標顯著相關,且相關系數均較大。

表4 水分脅迫對近等基因導入系種子萌發物質變化指標抗旱系數的影響Table4 Effects of water stress on drought coefficient of seed germination substance change index of NIILs

表5 水分脅迫下近等基因導入系種子萌發各指標抗旱系數相關性分析Table5 Correlation analysis of drought coefficient of seed germination indexes of NIILs under water stress

2.3 水稻近等基因導入系芽期抗旱性綜合評價

利用隸屬函數法進行綜合評價,各指標權重采用標準差系數法進行賦權,分別計算4個水分脅迫處理下6個參試材料的隸屬綜合值,結果見表6。C2的隸屬綜合值在4個水分脅迫下均排前三名,表現出較強的抗旱性,C6的隸屬綜合值在T5、T10、T20水分脅迫下排前三名,C3的隸屬綜合值在T10、T15水分脅迫下排前兩名。

利用各水分脅迫下14個指標的標準差系數之和作為4個水分脅迫處理的權重計算依據,計算4個水分脅迫處理隸屬綜合值的權重,以各材料在4個水分脅迫處理的隸屬值分別乘以各處理權重,再求和計算得出6份材料綜合D值。C2、C6、C3的綜合D值分別排前三名,綜合評價抗旱性較強。

表6 水稻近等基因導入系隸屬函數法綜合評價Table6 Comprehensive evaluation of rice NIILs by membership function method

以4個水分脅迫處理下6份材料隸屬綜合值與D值進行相關性分析(表7),T10、T15、T20的隸屬綜合值與D值的相關系數分別為0.86*、0.71、0.81*,均呈正相關關系,其中T10、T20的隸屬綜合值與D值顯著相關。同時,T20的權重最大(表6),結合相關性分析,T20對水稻近等基因系種子萌發影響效應強,指標變異度高,其隸屬綜合值與綜合D值顯著正相關。因此,以T20的指標抗旱系數與D值進行相關性分析(表8)。結果顯示,綜合D值與T20的發芽勢、活力指數、根長、儲藏物質轉化率的抗旱系數顯著相關,相關系數分別為-0.87、0.84、0.78、0.85。

表7 綜合D值及各處理隸屬綜合值相關性分析Table7 Correlation analysis of comprehensive D value and comprehensive value ofmembership of each treatment

表8 綜合D值與T20處理下各指標抗旱系數的相關系數Table8 Correlation coefficient between comprehensive D value and drought coefficient of eachindexes under T20 treatment

3 討論

水稻抗旱性為數量性狀,在基因作用機制上的研究表明水稻抗旱機制復雜,導致抗旱性表現復雜多變[20-23],因其復雜性在采用單一指標進行直接評價時,不同指標評價結果往往不一致,評價結果較為片面,因此抗旱性評價多采用綜合評價法,主要有隸屬函數法、主成分分析法、分級法、回歸分析法等[16,24-26]。本研究利用隸屬函數法進行綜合評價,通過D值判斷,C2、C6、C3材料的綜合D值排前三名,抗旱性強于其余3份材料,這6份材料通過全生育期干旱試驗研究表明,C2、C3的抗旱性較強[27],可見,芽期抗旱性篩選結果與全生育期抗旱篩選結果較為一致。王賀正等[25]研究表明,通過分級法綜合評價芽期品種抗旱性與大田全生育期鑒定結果基本相似,這與本研究結果較一致。但另有研究指出,芽期抗旱性鑒定結果與大田產量的抗旱系數之間不存在顯著相關性,芽期鑒定結果不能代表綜合抗旱水平[14],這與本研究結果存在差異,可能是由于其所采用的材料偏少(僅采用3個材料)造成的。由于處理方法、測定指標、評價方法等差異,相同材料在不同時期的抗旱性評價也不完全相同。因此,在研究抗旱性時,必須在一定材料數量基礎上進行綜合比較,才能避免部分材料抗旱性在不同時期出現細微排序變化,而造成評價結果不同。

目前抗旱性評價并無統一方法,若各時期測定指標較多,耗時耗力,尤其是大田期對大量材料進行抗旱鑒定時,工作量十分繁重,因此,多數研究通過分析各單項指標與抗旱性關系[14,18,28],以期篩選出測定簡便、通用性強的簡易指標即能準確評價抗旱性。本研究通過分析T20水分脅迫下各指標抗旱系數與綜合D值的相關性可知,活力指數抗旱系數、根長抗旱系數、儲藏物質轉化率與綜合D值相關系數分別為0.84*、0.78*、0.85*,表明這3個指標與綜合抗旱性高度正相關,同時指標間相關性分析顯示活力指數抗旱系數、儲藏物質轉化率抗旱系數與其他指標相關性較高,多數達顯著水平。活力指數結合了種子發芽情況及根芽生長,較全面反映了種子萌發表現,儲藏物質轉化率反映了種子萌發過程中物質轉化利用效率,受水分脅迫的直接影響,當物質轉化利用受阻,則種子發芽、根芽生長、物質形成均受抑制,因此結合相關性分析,活力指數、儲藏物質轉化率可作為種子芽期抗旱鑒定指標。田又升等[14]和王秋菊[15]的研究結果也顯示儲藏物質轉運速率與抗旱性顯著相關,可作為抗旱鑒定指標,與本研究結果較為一致。

由于干旱災害頻發,進一步改良水稻品種、提高水稻抗旱能力已成為抗旱栽培的重要工作[29-30]。近年來,不同研究者利用野生稻、秈粳稻雜交衍生系、旱稻突變體、不育系等不同材料開展了抗旱研究[16,31-32],并取得了相應成果。本研究采用近等基因導入系進行抗旱性研究,可進一步豐富抗旱鑒定材料,有利于發掘適宜多種材料的抗旱鑒定方法和指標。利用篩選出的抗旱性較強的材料培育優異抗旱性水稻品種,可有效將抗旱鑒定工作前移,提高抗旱育種效率。

4 結論

通過芽期模擬干旱脅迫試驗,結合隸屬函數綜合分析及相關性分析,篩選出儲藏物質轉化率、活力指數與綜合D值可作為抗旱性評價的指標。從抗旱性評價的科學性來說,儲藏物質轉化率可作為芽期模擬干旱脅迫試驗中的一級鑒定指標優先使用,活力指數與綜合D值可作為二級抗旱鑒定指標。由于抗旱的復雜性,鑒定方法、指標體系、評價方法等并不統一,帶來了鑒定結果差異,需進一步建立統一的、標準化的抗旱鑒定體系。同時,5818(川香29B/ASOMINDORI//29B///29B)、川香29B、5819(川香29B/ASOMINORI//29B///29B)三份材料抗旱性較強,可用于抗旱育種研究。