響應面法優化糜子油提取率

金 燦，李克虎，Harold Corke，降彥苗?

（1. 上海交通大學 農業與生物學院 食品科學與工程系，上海 200240；

2. 河北省農林科學院 谷子研究所，河北 石家莊 050035；3. 貴州大學 生命科學學院 生物技術系，貴州 貴陽 550025）

糜子（Panicum miliaceumL.）俗稱大黃米，屬于禾本科植物，被認為是人類歷史上最早馴化的谷物之一[1]。其籽粒富含淀粉、蛋白質、氨基酸、維生素和礦物質，多酚和纖維素也含量豐富[2-3]。有研究表明糜子油主要含亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸[4]，Shen等的研究也表明，糜子油脂肪酸組成主要以不飽和脂肪酸為主[5]。膳食中攝入不飽和脂肪酸可以有效降低患心血管疾病的風險[6]。隨著國民生活水平的不斷提高，人們越來越重視日常食用油的營養價值和質量安全，對食用油多樣化的需求明顯提高，市場上已經涌現出山茶油、紅花籽油、核桃油等多種多樣的食用油產品[7]。當前糜子產品結構單一，為了提升糜子的產品附加值，糜子油在食品及非食品工業中的應用值得探索。

目前，對糜子油的提取工藝研究不多。響應面法（Response Surface Methodology）是以數學科學為原理，利用統計方法，對所研究響應值進行優化，響應值的結果受多個變量影響。響應面法在許多研究領域都有非常廣泛的應用，涵蓋生物學、醫學、生態學、食品學、工程學等多個領域[8]。響應面法在食品領域中的應用主要有兩個方面：確定食品中各組分的相互作用已經確定各成分的比例、確定最優反應。本實驗旨在采用響應面法，以糜子油提取率為指標，明確液料比、提取溫度及提取時間對糜子油得率的影響，確定實驗室索氏提取糜子油的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糜子：寧夏固原；石油醚（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；礱谷機（JLG-ⅡA）：中儲糧成都儲藏研究院有限公司；高速粉碎機（HC-700Y）：永康市天祺盛世工貿有限公司；脂肪測定儀（SZC-101）：上海纖檢儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9030A）：上海精宏實驗設備有限公司；電子天平（LE204E/02）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糜子油提取方法

將糜子籽粒用礱谷機脫去外殼，烘干至恒重后，用高速粉碎機將糜子籽粒打成粉末狀備用。用濾紙準確稱取2 g（精確到0.001 g）糜子粉，包裹后放入濾紙筒。將樣品放入脂肪測定儀并打開循環冷凝水，樣品杯中加入一定比例的石油醚，在脂肪測定儀上經過浸泡 30 min、淋洗 30 min、回收15 min、蒸干10 min后取出浸提杯，于130 ℃下烘干40 min。然后，取出樣品杯進行稱重，計算糜子油的得率。重復三次實驗，計算得率的平均值。

式中：M1為提取后樣品杯與油的質量（g）；M0為提取前空的樣品杯的質量（g）；M為樣品糜子粉末的質量（g）。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 液料比對石油醚提取糜子油得率的影響設置提取溫度75 ℃，提取時間20 min，研究液料比（V/M）分別為5、10、15、20、25、30 mL/g時，對糜子油得率的影響。

索氏提取法：用濾紙準確稱取 2 g（精確到0.001 g）糜子粉，包裹后放入濾紙筒，放入脂肪測定儀并打開循環冷凝水，每個樣品杯中加入一定比例的石油醚，打開脂肪提取儀進行四個階段的溫度和時間設置：（1）浸泡：55 ℃，30 min；（2）淋洗：75 ℃，20 min；（3）回收：95 ℃，15 min；（4）蒸干：110 ℃，10 min。在液料比（V/M）分別為5、10、15、20、25、30 mL/g的條件下進行6個不同提取條件的提取實驗。然后，取出樣品杯進行稱重，計算糜子油的得率。每個提取條件下重復三次實驗，記錄得率的平均值。

1.2.2.2 提取時間對石油醚提取糜子油得率的影響 當提取溫度為 80 ℃，液料比（V/M）為20 mL/g時，研究提取時間分別為 10、15、20、25、30、35、40 min時，糜子油得率的變化。

操作步驟和實驗條件同 1.2.2.1，在第二步的提取（淋洗）時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min的條件下進行7個不同提取條件的提取實驗。每個提取條件下重復三次實驗，計算得率的平均值。

1.2.2.3 提取溫度對石油醚提取糜子油得率的影響 當提取時間為 30 min，液料比（V/M）為20 mL/g時，在提取溫度分別為65、70、75、80、85、90 ℃時，研究其對糜子油得率的影響。

操作步驟和實驗條件同 1.2.2.1，在第二步，將提取溫度分別設置為 65、70、75、80、85、90 ℃，進行6個不同提取條件的實驗。每個提取條件下重復三次實驗，計算得率的平均值。

1.2.3 響應面實驗設計

在對單因素實驗的結果進行分析的基礎上，運用Design Expert 10軟件設計響應面，對液料比、提取時間、提取溫度這 3個因素分別選定 3個水平，按中心組合設計尋找最佳提取工藝條件。液料比、提取時間、提取溫度的主要水平編碼表如表1和表2所示。

表1 單因素實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in one-factor experiments

表2 響應面實驗因素水平表Table 2 Factors and levels in response surface test

1.3 數據處理

單因素實驗結果用 Microsoft Office Excel 2016對其進行分析，利用Design Expert 10軟件對工藝參數的組合進行優化，利用響應面分析法（RSM）得到回歸模型和工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 提取液料比對糜子油得率的影響

以石油醚為提取溶劑，當提取溫度為75 ℃，提取時間為20 min時，研究液料比（V/M）分別為5、10、15、20、25、30 mL/g時，對糜子油的得率的影響。結果如圖1所示。

圖1 液料比對糜子油的得率影響Fig.1 Effect of liquid material ratio on yield of proso millet oil

由圖1可知，在液料比為5～20的范圍內，糜子油的得率與液料比呈正相關性，糜子油得率隨液料比的增大而增加。當液料比為20時，糜子油的得率達到最大值2.90%。當液料比大于20后，得率會隨液料比的增加而逐漸減小至平緩。

原因可能是在一定液料比的范圍內，溶劑量的增加提高了原料糜子粉與溶劑間的濃度差，促進了提取溶劑石油醚與原料糜子粉的接觸，因此糜子油的得率有所提高，但此時再繼續增加溶劑的用量，會導致溶劑揮發速度加快[9]，使糜子油的得率下降甚至趨于平緩，而且溶劑用量的加大還會增加物質成本。綜合考慮，最適液料比（V/M）范圍選取為 15、20、25 mL/g，進而繼續對糜子油的得率進行響應面分析，以確定最佳的液料比。

2.1.2 提取時間對糜子油得率的影響

以石油醚為提取溶劑，當提取溫度為80 ℃，液料比（V/M）為20 mL/g時，研究提取時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min時，對糜子油得率的影響。結果如圖2所示。

圖2 提取時間對糜子油的得率影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proso millet oil

結果表明，在10～30 min內，糜子油的得率與提取時間呈正相關，隨著提取時間的延長，糜子油的得率不斷增加。在30 min時，糜子油的得率為最大值2.91%。而當時間大于30 min之后，隨著時間的增加，糜子油的得率開始減小。

這可能是因為在一定時間范圍內，隨時間的延長，油料分子與溶劑分子的接觸會更加充分完全，有利于油脂的充分提取，因此得率隨著時間的延長而增加。在一定時間之后接觸達到平衡，此時再隨著時間的延長，原料分解，導致雜質溶出，從而降低糜子油的得率，甚至還會增加時間成本[10]。綜合考慮，提取溫度選取25、30、35 min這三個水平，繼續對糜子油的得率進行響應面分析，以確定最佳提取時間。

2.1.3 提取溫度對糜子油得率的影響

以石油醚為提取溶劑，當提取時間為30 min，液料比（V/M）為20 mL/g時，研究提取溫度分別為 65、70、75、80、85、90 ℃時，對糜子油得率的影響。結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對糜子油的得率影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of proso millet oil

由圖3可知，在65～80 ℃范圍內，糜子油的得率與提取溫度呈正相關性，得率隨提取溫度升高而增加。當提取溫度為 80 ℃時，糜子油的得率達到最大值3.01%。當提取溫度大于80 ℃后，其得率隨提取溫度的升高而減小。

原因可能是在適當的溫度條件下，分子熱運動隨溫度增加而劇烈，促進物料與溶劑分子間的相對運動，從而有利于油脂的浸出擴散。但當溫度過高接近溶劑沸點時，溶劑汽化量增加，揮發性物質增多，壓力增加，從而阻礙了油脂浸出[11]。綜合考慮，提取溫度選取 75、80、85 ℃三個水平，繼續對糜子油得率進行響應面分析，以確定最佳提取溫度。

2.2 石油醚提取糜子油工藝優化響應面實驗

2.2.1 響應面實驗模型擬合

為了獲得索氏提取法提取糜子油的最佳工藝條件，采用正交設計法，以得率為響應值，研究不同因素之間的綜合效應，根據單因素實驗結果，對液料比（mL/g）、提取時間（min）、提取溫度（℃）進行3因素3水平實驗設計。

以單因素實驗結果為依據，以液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、三個因素為自變量，以糜子油得率（Y）為響應值，通過 Design-Expert 10軟件對糜子油提取工藝的參數進行Box-Benhnken實驗設計。實驗因素和水平的設計如表3所示。

表3 響應面實驗因素組合表Table 3 Combination of experimental factors in response surface test

2.2.2 響應面實驗結果顯著性分析

響應面分析方案及實驗結果如表4所示；回歸模型和方差分析結果如表5所示。

表4 響應面實驗結果表Table 4 Results of response surface test

用Design-expert得到了二次多元回歸擬合方程：Y=3.00+0.056A+0.050B+0.10C–0.12AB+0.030AC–0.023BC–0.41A2–0.35B2–0.31C2

對此模型方程進行方差分析，從表 5的方差分析結果中可以看出回歸模型呈極顯著（P<0.01），失擬項無顯著性（P>0.05），回歸方程的相關系數R2=0.991 3，校正后的相關系數。意味著方程中的自變量與因變量的線性關系顯著，該方程可用于石油醚索氏提取糜子油的提取工藝優化。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance in regression model

各實驗因素對糜子油提取率的影響為：C>A>B，一次項中A的偏回歸系數顯著（P<0.05），說明液料比對糜子油的提取率有顯著性影響，B的偏回歸系數顯著（P<0.05），說明提取時間對糜子油的提取率有顯著影響，而C的偏回歸系數極顯著（P<0.01），說明提取溫度對糜子油的提取率有極顯著影響。交互項AB對提取率影響極顯著（P<0.01），AC、BC對提取率的影響不顯著（P>0.05）。二次項中的A2、B2和C2對提取率的影響均為極顯著（P<0.01）。

2.3 響應面和等高線圖分析

2.3.1 提取時間和液料比的交互作用

在提取溫度為 80 ℃下，三維面較陡，等高線呈橢圓形。表明提取時間和液料比的交互作用顯著，用石油醚提取糜子油的得率受到二者的共同影響。其中液料比坡度比提取時間的三維面稍微陡一些，說明液料比對糜子油的得率有顯著性影響。當提取時間在27～31 min之間，液料比在19～23 mL/g之間時，糜子油的得率達到最大值，隨著提取時間和液料比的變化，糜子油的得率會下降。

圖4 因素A、因素B響應面分析圖及等高線分布圖Fig.4 F actor A, B response surface analysis map and contour map

2.3.2 提取溫度和液料比的交互作用

在提取時間在30 min時，三維面較陡，說明糜子油的得率受到二者的共同影響。等高線呈圓形，說明提取溫度和液料比的交互作用不明顯。其中提取溫度和液料比都對糜子油的得率有顯著影響。當提取溫度在79～83 ℃范圍內，液料比在19～23 mL/g范圍內，糜子油的得率達到最大值，隨著提取溫度和液料比的變化，糜子油得率會下降。

圖5 因素A、因素C響應面分析圖及等高線分布圖Fig.5 F actor A, C response surface analysis map and contour map

2.3.3 提取溫度和提取時間的交互作用

在提取的液料比為20 mL/g的條件下，三維面較陡，等高線呈圓形。表明提取溫度和提取時間的交互作用不顯著，但其中提取溫度和提取時間都對糜子油的得率有顯著影響。當提取時間在29～33 min之間，提取溫度在79～83 ℃之間時，糜子油的得率達到最大值，隨著提取溫度和提取時間的變化，糜子油得率會下降。

圖6 因素B、因素C響應面分析圖及等高線分布圖Fig.6 F actor B, C response surface analysis map and contour map

3 結論

用Design-Expert對數據進行預測以確定糜子油索氏提取工藝條件的最佳參數。結果表明：液料比為20.34 mL/g、提取時間為30.27 min、提取溫度為 80.86 ℃時，在此提取條件下糜子油的預測最高得率為3.008%。為了實驗的方便和可操作性，對此模型進行修正為：液料比為 20 mL/g、提取時間為30 min、提取溫度為80 ℃。在修正后的提取條件下，糜子油的得率為 3.01%，與預測結果接近，證明該模型可以用于索氏提取法提取糜子油并驗證其得率的相關實驗。