小桐子毛油酶法脫膠工藝研究及機理分析

趙光輝，孫淑坤，曾群英，楊春基，馬克存

（中國石油天然氣股份有限公司 石油化工研究院，黑龍江 大慶 163714）

我國有上千種油料植物，其中以小桐子為代表的木本油料具有含油量高、適應范圍廣、耐干旱貧瘠等特點，廣泛栽培或野生于我國的云南、四川、貴州、海南和廣東等非農田用地，這不僅符合我國生物質能源“不與人爭糧，不與糧爭地”的發展原則，而且對改善生態環境、調整農業產業結構、促進農村經濟發展、增加農民收入等都具有十分重要的意義。小桐子種籽的含油率在28%～40%之間，脫皮后種仁的含油率最高可達60%，是木本油料中含油量最高的一種植物[1]。其種籽經萃取或壓榨出的毛油主要成分是甘油三酯和游離脂肪酸，同時含佛波醇酯和毒蛋白，有毒，不可食用，但卻是制備生物液體燃料（航空生物燃料和生物柴油）和其它化工品的理想原料[2-4]。

由于小桐子毛油中存在一定量的膠溶性雜質，這些雜質通常條件下與蛋白質、黏液質及鈣、鎂、鐵、鉀等金屬結合成配位化合物，形成1～100 nm的膠溶態微粒分散于毛油中[5-7]。將會對后續的脫色處理、貯存穩定性及下游用戶造成極大影響，因此高效的脫膠技術已成為小桐子油應用的關鍵。目前國內外油脂加工廠普遍采用水化脫膠、酸法脫膠或堿煉等傳統工藝脫除膠質，具有工藝簡單易行、操作性強等優勢，但也存在甘油三酯損失大、輔料消耗多及三廢排放等問題[8-9]。而酶法脫膠具有反應過程溫和、工藝簡便、出油率高、節約能源及環境友好等優勢，受到了學者和企業的廣泛關注。本文通過對酶法脫膠工藝研究及機理分析，以期為小桐子油的工業化生產提供科學依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

小桐子毛油：磷含量221.8 μg/g，游離脂肪酸3.92%，自制；復合磷脂酶（磷脂酶B和磷脂酶C復配）：夏盛實業集團有限公司。

檸檬酸、硝酸、鹽酸、過氧化氫：阿拉丁控股集團；硫酸鈉、氧化鉀：天津渤化化學試劑有限公司；甲醇、乙醇、石油醚、異辛烷：天津市瑞金特化學品有限公司。

Optima 5300DV型等離子發射光譜儀：美國PerkinElmer公司；ANTEK9000型總氮分析儀：美國ANTEK公司；Multi EA5000型總硫分析儀：德國耶拿公司；ECS3000型總氯分析儀：賽默飛世爾公司；Agilent7890氣相色譜：安捷倫科技公司；ZK072型干燥箱：上海滬粵明科學儀器有限公司；BT323S型電子天平：賽多利斯電子有限公司；TDL-5A型離心機：凱特實驗儀器有限公司。

1.2 毛油酶法脫膠方法

準確稱取300 g小桐子毛油于500 mL的三口燒瓶中，水浴加熱到 75 ℃后加入 50%檸檬酸0.42 g，高剪切攪拌條件下反應30 min。然后冷卻至55 ℃以下，加入適量5%的NaOH溶液混合均勻，將反應體系調整到試驗需要的 pH范圍。再加入一定量的水稀釋酶液，在預設溫度和轉速條件下反應。反應結束后進行離心分離，除去膠質，取定量樣品進行分析。

1.3 分析方法

磷和金屬含量：參照GB/T17476—1998；氮含量：參照ASTM D5762—2012；硫含量：參照ASTM D5453—2008；氯含量：參照 ASTM D5808—2009a；不皂化物含量：參照GB/T5535.1—2008；游離脂肪酸含量：參照GB/T5530—2005。

2 結果與分析

2.1 酶法脫膠單因素試驗

2.1.1 反應體系pH對脫膠效果影響

在酶加量40 μg/g、反應溫度50 ℃、反應時間2.5 h、攪拌轉速300 r/min的條件下，通過控制NaOH溶液的加量，考察了反應體系pH對脫膠效果影響，結果如圖1所示。

圖1 反應體系pH對脫膠效果影響Fig.1 The pH of the reaction solution to degumming effect

由圖1可見，隨著反應體系 pH升高，脫膠油中的磷含量明顯降低；當pH超過5.0以后，脫膠油中磷含量反而升高，這主要是隨著堿量增加，導致磷脂酶活性降低所致，因此選擇反應體系pH5.0時較適宜。

2.1.2 磷脂酶加量對脫膠效果影響

在反應溫度50 ℃、反應時間2.5 h、攪拌轉速300 r/min、pH5.0的條件下，考察了磷脂酶加量對脫膠效果影響，結果如圖2所示。

圖2 酶加量對脫膠效果影響Fig.2 Enzyme dosage to degumming effect

由圖2可見，脫膠油中的磷含量隨著酶加量的增加而降低，當酶加量超過40 μg/g以后，脫膠油中的磷含量降低趨勢變緩。由此可見，磷脂酶加量在一定范圍內決定著脫膠效果，再提高磷脂酶加量對脫膠效果的影響并不明顯，但會增加脫膠成本。從經濟性方面考慮，確定酶加量40 μg/g較適宜。

2.1.3 反應溫度對脫膠效果影響

在反應時間2.5 h、攪拌轉速300 r/min、pH5.0、酶加量40 μg/g的條件下，考察了反應溫度對脫膠效果影響，結果如圖3所示。

圖3 反應溫度對脫膠效果影響Fig.3 Reaction temperature to degumming effect

由圖3可見，隨著反應溫度的升高，脫膠油的磷含量呈先降低后上升的趨勢，當溫度為55 ℃時，此時脫膠油含磷量降至14.36 μg/g，說明酶促進脫膠反應達到最大水平。由于溫度過低或過高都會影響酶的活性，因此確定脫膠反應的最適溫度為55 ℃。

2.1.4 反應時間對脫膠效果影響

在攪拌轉速 300 r/min、pH5.0、酶加量 40 μg/g、反應溫度 55 ℃的條件下，考察了反應時間對脫膠效果影響，結果如圖4所示。

圖4 反應時間對脫膠效果影響Fig.4 Reaction time to degumming effect

由圖4可見，隨著反應時間的增加，脫膠油含磷量呈現遞減趨勢。當反應時間超過3.0 h后，磷含量基本不再發生變化，因此較優的酶反應時間確定為3.0 h。

2.1.5 攪拌轉速對脫膠效果影響

在pH5.0、酶加量40 μg/g、反應溫度55 ℃、反應時間3.0 h的條件下，考察了攪拌轉速對脫膠效果影響，結果如圖5所示。

由圖5可見，攪拌轉速在250～350 r/min范圍內時，增加轉速能夠使磷脂酶和水在油相中分散均勻，反應界面越大，脫膠油中的磷含量越低。但隨著攪拌繼續增加，可能是由于攪拌形成的剪切力影響了酶的活性或反應體系乳化造成磷脂的殘留，從而造成脫膠效果，因此確定脫膠反應轉速為350 r/min。

2.2 酶法脫膠正交試驗

根據單因素酶法脫膠試驗結果，選取pH、酶加量、反應溫度、反應時間和攪拌轉速等五個因素作為變量，每個因素選取4個水平，以脫膠油中的磷含量作為考察指標，根據因素數和水平數選擇L16(45)正交表開展脫膠試驗，結果見表1。

由極差分析結果可知，表1中正交試驗各因素的影響順序依次是酶加量＞pH＞反應溫度＞攪拌轉速＞反應時間，由正交試驗結果可以看出優化后的組合為A3B4C3D2E1，即在酶加量 50 μg/g、pH5.5、反應溫度50 ℃、攪拌轉速350 r/min、反應時間2 h的條件下，酶法脫膠試驗效果最好。

2.3 酶法脫膠驗證試驗及微量組分分析

以小桐子毛油為原料，在酶加量 50 μg/g、pH5.5、反應溫度50 ℃、攪拌轉速350 r/min、反應時間2 h的條件下，開展了酶法脫膠工藝驗證試驗，并對脫膠油中的微量組分進行了分析，試驗數據見表2。

表1 正交試驗設計與結果Table 1 Orthogonal test design and results

表2 酶法脫膠驗證試驗及脫膠油微量組分分析Table 2 Enzymatic degumming verifying test and analysis of trace components in degumming oil

從表2可以看出，在該條件下進行驗證試驗，脫膠油中的磷含量最低為9.93 μg/g。脫膠油中的磷、金屬及氮的含量大幅度降低，這主要是由于毛油磷脂中含有金屬離子和氨基，在脫膠過程中酶可將非水化磷脂中的?；袛噢D化為溶血性磷脂或磷脂?；?，與水化磷脂遇水時形成液態水合結晶[10-11]，再同硫化物、氯化物、不皂化物等同時被沉淀分離出來，使脫膠油中的雜質得到不同程度的降低，這對于油品儲存及下游用戶的應用是非常有利的。由于毛油脫膠反應體系中存在堿液和水，在一定條件下會造成甘油三酯水解，生成游離脂肪酸，導致脫膠油酸度有所升高。

2.4 酶法脫膠反應機理分析

毛油中的膠質主要是磷脂，所以說“脫膠”也稱“脫磷”。根據磷脂酸羥基相連的官能團不同，磷脂通常分為水化磷脂和非水化磷脂。酶法脫膠就是利用磷脂酶與油中的非水化磷脂發生特異性反應，切除非水化磷脂中的一個或兩個脂肪酸，生成水化磷脂[12-13]。然后再利用水化磷脂具有很強親水性的特點，通過沉淀或離心分離從油中除去。此法減少了精煉過程中酸堿用量和廢水排放量，提高了生產效率，降低了經濟成本，顯示出明顯優勢和發展潛力。

圖6 不同磷脂酶的作用位點Fig.6 The site of different phospholipase Hydrolysis phosholipids

由圖6可見，試驗采用磷脂酶B和磷脂酶C的復合酶，直接作用于磷脂的1號和2號位以及甘油與磷酸鹽之間的P-O鍵上進行特異性反應。其中磷脂酶B能特異性水解磷脂1號和2號位上的脂肪酸，生成游離脂肪酸和溶血磷脂[14-16]。由于溶血磷脂具有較強的親水性，可以通過水化作用去除。磷脂酶 C作用于甘油與磷酸鹽之間的P-O鍵，使磷脂分解為親水性組分和溶于油脂的甘油二酯，從而減少油腳產出及其夾帶損失，增加了中性油的產出，具有良好的應用前景。磷脂酶C在生物細胞較為常見，目前己有企業通過發酵培養無毒、無致病性的轉基因畢赤酵母，提取磷脂酶C，用于油脂的脫膠[17-18]。

3 結論

利用正交試驗對酶法小桐子毛油脫膠工藝進行了優化，確定最佳工藝條件為A3B4C3D2E1，即在酶加量50 μg/g、pH5.5、反應溫度50 ℃、攪拌轉速350 r/min、反應時間2 h的條件下，脫膠油的磷含量可降9.93 μg/g，其它雜質也有不同程度的降低，說明開發出的酶法脫膠工藝除雜效果明顯。

由于小桐子毛油中的磷、金屬、氮等雜質受產地、品種、儲藏時間及壓榨工藝等多因素的影響，其含量變化大、性質均不相同，因此油脂加工企業應根據毛油的性質及產品要求，選擇適當的磷脂酶和脫膠工藝條件，以期達到最佳效果。