基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的葡萄籽油抗癌和抗腫瘤功能成分及機制研究

張麗明，馬雅鴿，張 希，趙聲蘭?，陳朝銀，梁仲雄

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2. 云南經(jīng)濟管理學(xué)院，云南 昆明650106；3. 云南成滿生物科技有限公司，云南 大理 671600）

癌癥是嚴(yán)重危害人類身體健康的常見疾病。據(jù)全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)GLOBOCAN 2018估計，世界癌癥新發(fā)病例約有 1 808萬例，而死亡病例約 956萬例，其中中國分別約占 23.7%和30%。在地域發(fā)病情況方面，亞洲的癌癥死亡數(shù)占全球 57.3%，且預(yù)后差、死亡率高的癌癥類型在這些地區(qū)發(fā)生率較高[1]。癌癥的發(fā)病形勢日益嚴(yán)峻，使得腫瘤預(yù)防和治療的社會壓力和醫(yī)療壓力與日俱增。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對癌癥的治療主要以手術(shù)、化療、放療及靶向藥物為主，由于其較大的副作用及腫瘤自身的消耗性，患者正氣虛弱、氣血虧損，治療效果不盡人意，甚至出現(xiàn)“一邊治療，一邊轉(zhuǎn)移”的現(xiàn)象[2]。近幾年來，中藥由于其藥源廣泛，副作用小等特點備受關(guān)注，成為抗腫瘤藥物研究的熱點[3]。

葡萄籽是葡萄科葡萄屬植物葡萄（Vitis viniferaL.）的種子。葡萄籽油是葡萄籽活性部位之一，含有豐富的亞油酸[4]、維生素E[5-6]、植物甾醇[7-8]、多酚[9-10]、角鯊烯[11]和類胡蘿卜素[12]等活性成分，具有延緩衰老、抑制肥胖、抗癌、抗腫瘤、抗炎、降血脂等生物功能[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要通過文獻(xiàn)挖掘等方法構(gòu)建生物信息網(wǎng)絡(luò)，通過分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及選取特定信號節(jié)點進(jìn)行藥物作用多靶點預(yù)測，其研究思路與中醫(yī)藥整體觀念相一致，可應(yīng)用于解決中藥及復(fù)方研究中多成分、多靶點、協(xié)同作用特點帶來的難題[14]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘葡萄籽油抗癌和抗腫瘤的活性成分及作用靶點，揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 葡萄籽油活性成分及靶點的收集

通過查閱文獻(xiàn)收集葡萄籽油的活性成分及利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）獲得其口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug-likeness，DL）和小腸上皮細(xì)胞滲透率（Caco-2 permeability）值及各活性成分對應(yīng)靶點，匯集靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將藥物靶點的蛋白名稱轉(zhuǎn)換成GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）的基因名稱。

1.2 癌癥/腫瘤相關(guān)靶點的搜集

從在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://www.omim.org/）和人類基因數(shù)據(jù)庫（Gene-Cards，https://www.genecards.org/）中收集與關(guān)鍵詞“cancer”和“tumor”相關(guān)的靶點，整理獲得癌癥和腫瘤相關(guān)靶點。

1.3 活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

使用Venn在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將活性成分靶點-癌癥和腫瘤相關(guān)靶點取交集，獲得葡萄籽油的潛在抗癌和抗腫瘤靶點。將交集靶點導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2軟件[15]，建立藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。圖中節(jié)點（node）代表葡萄籽油、活性成分、靶點、疾病，邊（edge）分別代表活性成分和靶點或靶點和疾病的交互作用。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

將篩選得到的潛在抗癌和抗腫瘤靶點導(dǎo)入String[16]（https://string-db.org， ver 11.0）在線平臺數(shù)據(jù)庫，以研究靶蛋白相互作用，設(shè)置物種為“人類”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）。在PPI圖中，每一個實心圓圈代表一個基因，圓圈的中間顯示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而圓圈由不同顏色的線條連接。每一線條代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的生物學(xué)過程，包括基因表達(dá)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移等。

1.5 GO 功能和KEGG通路富集分析

采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），對葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點進(jìn)行GO功能分析，以了解靶點的生物學(xué)過程，KEGG通路分析研究藥物靶點主要信號通路，DAVID平臺列表與背景均設(shè)置為“Homo sapiens”（人類），GO富集分析選擇生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組成（cellular component）3個模塊，通路分析選擇KEGG。

2 結(jié)果

2.1 葡萄籽油活性成分及靶點的篩選

通過已有文獻(xiàn)報道[17-20]，篩選得到葡萄籽油主要活性成分15種，為脂肪酸及其油脂伴隨物。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）檢索到葡萄籽油主要活性成分除角鯊烯外均有對應(yīng)靶點，總計 366個，刪除重復(fù)項，共獲得 236個活性成分靶點。葡萄籽油主要活性成分信息見表1。

2.2 葡萄籽油活性成分抗癌和抗腫瘤靶點收集

在兩個疾病數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“cancer”和“tumor”進(jìn)行疾病靶點搜索，GeneCards數(shù)據(jù)庫以 score≥30進(jìn)行篩選，得到 667個，OMIM數(shù)據(jù)庫得到24個，合并獲得686個癌癥和腫瘤相關(guān)靶點。利用Venn在線軟件將葡萄籽油活性成分對應(yīng)的209個藥物靶點（刪除未找到基因名稱的靶點）與癌癥及腫瘤相關(guān)的686個疾病靶點取交集，通過Venn圖（如圖1）的形式得到93個葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點（見表2）。

圖1 藥物靶點與疾病靶點關(guān)系圖Fig.1 The relationship between drug targets and disease targets

表2 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點信息Table 2 Information on potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

續(xù)表2

2.3 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 Cytoscape 3.7.2軟件建立藥物-活性成分-靶點-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖 2），共有108個節(jié)點、390條邊，其中紅色節(jié)點代表葡萄籽油，13個紫色節(jié)點代表葡萄籽油的活性成分，93個藍(lán)色節(jié)點代表癌癥和腫瘤靶點，黃色節(jié)點代表癌癥和腫瘤，390條邊代表節(jié)點之間的相互作用。該網(wǎng)絡(luò)中化合物的平均度值為22.77，由高到低依次為 Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）（degree=158）、ursolic acid（熊果酸）（degree=68）、(-)-epicatechin（表兒茶素）（degree=24）、palmitic acid（棕櫚酸）（degree=14）、(+)-catechin（兒茶素）（degree=6）、Stigmasterol（豆甾醇）（degree=6）、Vitamin E（維生素 E）（degree=4）、stearic acid（硬脂酸）（degree=4）、oleic acid（油酸）（degree=4）、brassicasterol（菜籽甾醇）（degree=2）、Erucic acid（芥酸）（degree=2）、Linolenic acid（亞麻酸）（degree=2）、Linoleic acid（亞油酸）（degree=2），其中反式白藜蘆醇、熊果酸、表兒茶素、棕櫚酸等可能是主要抗癌和抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖可知，Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）作用于PTGS2、BCL2、IL10、TNF、PTEN、PLAU、CAT、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CCL2、IL1A、RELA 等 79個靶點，ursolic acid（熊果酸）作用于PTGS2、BCL2、TNF、PLAU、JUN、IL6、CASP3、CREB1、RELA、STAT3等34個靶點，(-)-epicatechin（表兒茶素）作用于 PTGS2、TNF、PLAU、ESR1、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CREB1、CCL2、IL2、IL1A這12個靶點，palmitic acid（棕櫚酸）作用于 PTGS2、CTSD、BCL2、IL10、TNF、COL1A1、PTEN這7個靶點；靶點PTGS2與Linoleic acid（亞油酸）、oleic acid（油酸）、palmitic acid（棕櫚酸）、stearic acid（硬脂酸）、Linolenic acid（亞麻酸）、Erucic acid（芥酸）、Stigmasterol（豆甾醇）、Vitamin E（維生素E）、(+)-catechin（兒茶素）、(-)-epicatechin（表兒茶素）、Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）、ursolic acid（熊果酸）這 12個化合物相互作用，TNF、PLAU等多個靶點均與(-)-epicatechin（表兒茶素）、Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）、ursolic acid（熊果酸）作用，體現(xiàn)了葡萄籽油多成分、多靶點協(xié)同抗癌和抗腫瘤的作用。

圖2 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Active ingredients of grape seed oil-anti-cancer and anti-tumor target network

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用String在線平臺對葡萄籽油的93個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置物種為“人類”，將蛋白相互作用評分置信度設(shè)置為0.900，隱藏離散的靶點，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖（如圖3）。該網(wǎng)絡(luò)中包含93個節(jié)點，482條邊，平均節(jié)點度為 10.4。根據(jù)節(jié)點度值大小，關(guān)鍵靶點依次有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（STAT3）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原激活的蛋白激酶 3（MAPK3）、腫瘤抑制蛋白 p53（TP53）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原激活的蛋白激酶8（MAPK8）、原癌基因 c-Fos（FOS）、白介素 6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、雌激素受體（ESR1）、半胱天冬酶 8（CASP8）、半胱天冬酶 3（CASP3）等，這些靶蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，與其他多個靶點相連，可能與葡萄籽油發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用關(guān)系密切。

圖3 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

2.5 GO 功能富集分析

將葡萄籽油 93個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進(jìn)行GO富集分析（見圖4），獲得607條生物學(xué)過程條目，其中P＜ 0.05的生物學(xué)過程有477條，富集的前20個生物學(xué)功能依次為蛋白質(zhì)結(jié)合（84個靶點）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（28個靶點）、酶結(jié)合（23個靶點）、蛋白質(zhì)異二聚活性和蛋白質(zhì)均二聚活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（19個靶點）、蛋白激酶結(jié)合（15個靶點）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合（14個靶點）、序列特異性DNA結(jié)合（14個靶點）、細(xì)胞因子活性（12個靶點）、RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性DNA結(jié)合（11個靶點）、轉(zhuǎn)錄激活子活性及RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合（10個靶點）、生長因子活性和蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合及激酶活性（9個靶點）、蛋白酶結(jié)合（8個靶點）、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性（6個靶點）、蛋白磷酸酶2A結(jié)合和腫瘤壞死因子受體結(jié)合（5個靶點）、BH3域結(jié)合（4個靶點），表明葡萄籽油可通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用。

2.6 KEGG 信號通路分析

對葡萄籽油 93個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進(jìn)行KEGG通路注釋分析，獲得119條信號通路條目，其中P＜ 0.05的通路有113條，包括大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等通路，涉及 NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、ErbB信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、Wnt信號通路等經(jīng)典信號通路，排名靠前的條目有癌癥通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、細(xì)胞凋亡、癌癥中的蛋白聚糖通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的MicroRNA通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、炎性腸病（IBD）、Toll樣受體信號通路、慢性粒細(xì)胞白血病、甲狀腺激素信號通路、HIF-1信號通路等。由此推測，葡萄籽油可能通過調(diào)節(jié)以上信號通路來發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用，富集的前 20條通路分析結(jié)果見表 3。

圖4 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點GO富集結(jié)果柱形圖Fig.4 Bar graph of GO enrichment results of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

3 討論

葡萄籽油是一種性能良好、營養(yǎng)價值極高、對人體無毒無害無副作用且完全符合食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的功能型食用油脂，因其豐富的不飽和脂肪酸組成、無煙特性且加熱不易產(chǎn)生有害物質(zhì)等特點而成為近年來備受歡迎的高端食用油[13]。目前關(guān)于葡萄籽油抗癌研究較少，有研究結(jié)果顯示，葡萄籽油對HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用[21]。另有報道，葡萄籽油已被嘗試作為納米制劑的載體用于癌癥的治療[22]。根據(jù)文獻(xiàn)報道[13，18]，葡萄籽油含有亞油酸、多酚類物質(zhì)、維生素 E、植物甾醇、角鯊烯等成分，這些成分均有抗癌和抗腫瘤的生物學(xué)功能，可見葡萄籽油在治療癌癥和腫瘤方面潛力極大。本研究結(jié)果顯示，反式白藜蘆醇、熊果酸、表兒茶素、棕櫚酸等化合物在葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)中與其他多個疾病靶點相連，可能是主要抗癌和抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)。反式白藜蘆醇、表兒茶素均為多酚類物質(zhì)，此外，豆甾醇、維生素 E、菜籽甾醇、亞油酸雖不是關(guān)鍵靶點，但與疾病靶點也有一定關(guān)聯(lián)，說明本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道相吻合。另外，角鯊烯也具有抗腫瘤作用[13]及有效預(yù)防和抑制化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌、胰腺癌、皮膚癌等多種癌癥的發(fā)生[18]，可能是由于其在植物油脂中存在量較少、研究較少，所以未能在數(shù)據(jù)庫中找到其作用靶點。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，葡萄籽油抗癌和抗腫瘤的關(guān)鍵靶點依次為 STAT3、MAPK1、MAPK3、TP53、JUN、AKT1、RELA、TNF、MAPK8、FOS、IL6、VEGFA、MYC、ESR1、CASP8、CASP3等，這些關(guān)鍵靶點參與調(diào)控酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、BH3域結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、生長因子活性、序列特異性 DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性及RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合、蛋白磷酸酶 2A結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性 DNA結(jié)合、激酶活性等生物學(xué)功能，參與大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等通路的調(diào)控，NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、ErbB信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、Wnt信號通路等經(jīng)典信號通路的調(diào)控。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，預(yù)測了葡萄籽油抗癌和抗腫瘤作用的功能成分及作用靶點、生物學(xué)過程與富集通路，從分子的角度探討其抗癌和抗腫瘤作用機制，體現(xiàn)了葡萄籽油通過多成分、多靶點、多途徑的方式來治療癌癥和腫瘤。