大棗多糖對小鼠淋巴細胞免疫調節作用的研究

李鳳嬌，李敬雙，王一倫，金 鑫，李 賢，于 洋?

（錦州醫科大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001）

大棗（Ziziphus jujuba Mill），鼠李科植物棗的干燥成熟果實，主要分布在亞洲和美洲的熱帶和亞熱帶，少數分布在非洲和兩半球溫帶，大棗味美甘甜，營養價值豐富，我國已有幾千年的栽培歷史，大棗也是脾胃虛弱、氣血不足、倦怠無力、失眠多夢等患者良好的保健營養品。此外，大棗對慢性肝炎、肝硬化、貧血、過敏性紫癜等病癥有較好療效，典型的藥食同源之品。

大棗多糖（Jujube polysaccharide，JP）是大棗中一種重要的活性物質，具有多種生理活性，將其提取、純化、分級[1]，可作為免疫促進劑。大棗多糖能控制細胞的分裂和分化，調節細胞的生長與衰老[2]；能有效清除人體內的氧自由基[3]。大棗多糖是抗衰老的主要活性成分，具有明顯抗補體活性，且中性多糖的活性要強于酸性多糖。研究發現，大棗多糖具有抗氧化活性[4]、免疫調節活性[5]、保肝作用[6]、抗高脂血癥作用[7]、抗腫瘤作用[8]、減緩疲倦[9]。可廣泛應用于醫藥、保健食品及功能食品，作為綠色生物醫藥產品，大棗多糖具有廣闊的市場前景和應用價值。

隨時代的進步，關于大棗多糖的造血功能、抗氧化功能、修復肝損傷、抗疲勞、改善腸道、抑制腫瘤細胞等的報道越來越多，大棗多糖毒性低，不良反應少，為了廣泛應用于臨床和保健食品，大棗多糖的抗癌、抗氧化和增強免疫力的研究仍將是未來研究重點，因此，進一步探討其作用機制對于為大棗多糖的深入研究、飼料添加劑的研制和開發具有重要意義。

本文以大棗多糖為研究對象，建立免疫模型，通過 MTT法觀察大棗多糖對小鼠淋巴細胞增殖的影響；ELISA法觀察大棗多糖對小鼠淋巴細胞上清液中IL-2、IL-6、IL-10、IL-12水平的影響；QRT-PCR檢測大棗多糖對小鼠淋巴細胞 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12信使核糖核酸（mRNA）的表達，為大棗多糖的進一步開發與利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Balb/c小鼠 SPF級，體重在（20±2）g，8～10周齡，飼養條件20～26 ℃，錦州醫科大學生命科學院，生產許可證號為SCXK (遼)2014～0004。

1.1.2 藥品

大棗多糖，純度≥90%：晨光生物技術有限公司；四季青優級胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司產品；甲基噻唑藍298-93-1（MTT）、臺盼藍（Trypan Blue）、RPMI-1640培養基-11875、二甲基亞砜 D8370-100（DMSO）、紅細胞裂解液（Tris-NH4Cl）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和氯仿-P1014：北京索萊寶科技有限公司；Trizol-R0016：碧云天生物技術；異丙醇、乙醇：山東旭晨化工科技有限公司；小鼠IL-2、IL-6、IL-10和IL-12 mRNA細胞因子檢測試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；TaKaRa逆轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus）試劑盒RT-PCR試劑盒RR047A TAKARA、QPCR試劑盒RR820A TAKARA：寶生物工程有限公司。

1.1.3 儀器

Varioskan FlashT多功能酶標儀：美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作 SW-CJ-1F型：蘇州凈化設備有限公司；倒置顯微鏡 CKX41SF：日本OLYMPUS公司；低速離心機 TD5A：湖南赫西儀器裝備有限公司；96孔或24孔板臺式離心機：上海安亭(TDL80-2B)；CO2培養箱：日本SHELLAB；FA2004N型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；Mastercyler ep realplex4型實時熒光定量PCR儀、AG 22331 Hamburg型PCR擴增儀、BioPhotometer plus型蛋白核酸分析儀：德國 Eppendorf公司；全自動凝膠成像系統：中國Tanon 2500。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞懸液的制備

參考桑卡娜等[10]、馬玉芳等[11]實驗方法，頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠身體浸泡在75%酒精3 min消毒，注意不要將小鼠口鼻浸入酒精，將浸泡后的小鼠放在培養皿中移到無菌超凈工作臺內取出脾臟，放于盛有磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的平皿中沖洗干凈，將脾臟用10 mL注射器拉桿柄尾部將其磨碎，使脾臟通過200目濾網浸入1640培養基中。收集全部的細胞懸液于離心管中吹勻，將離心機調整至1 500 r/min 4 ℃，離心5 min，將上清液棄去，使用移液槍將紅細胞裂解液（Tris-NH4Cl）滴加3 mL至大離心管中吹勻重懸，靜置5 min，離心5 min，棄去上清液，若離心管中仍存在紅細胞，重復操作至紅細胞完全裂解。加入適量 RPMI-1640完全培養基（胎牛血清3 mL，1640 27 mL，配成30 mL的完全培養基）重懸沉淀細胞，離心棄上清，取900 μL細胞懸液置于EP管內，加100 μL臺盼藍（Trypan Blue）溶液，染色計數細胞活力，混勻后，吸出少量混合液放在計數板上，在顯微鏡下倒置觀察，調整直至細胞活力≥95%。用RPMI-1640完全培養液調整細胞密度為5×106個/mL，得到淋巴細胞懸液。

1.2.2 分組方式和分組處理

由于我國目前的司法改革主要以借鑒美國法律為趨勢，而德國是較早且較為細致地將技術偵查法治化的國家[4]，我國法律對上述問題并無明文規定，因此本文先介紹美國通訊監察法的相關規定，并與大陸法系的德國法進行比較，以便為我國立法及司法實務的運作提供參考，之后在詳細分析我國刑事訴訟法有關該制度規定所存在的主要問題的基礎上，提出構建偶然監聽所得材料的證據能力規則的具體建議。

設置空白組，陽性對照組（左旋咪唑），大棗多糖組（終濃度為 20、40、80、160、320 μg/mL），空白組孔中加入RPMI 1640完全培養基，大棗多糖組加入不同濃度的大棗多糖溶液，陽性對照組加入左旋咪唑。

1.2.3 MTT法檢測大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響

參考張思哲等[12]實驗方法，上述制備好的淋巴細胞懸液加到96孔板中，每組設置5個復孔，每孔 100 μL，將加入淋巴細胞的培養板置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養2 h，2 h后加藥。將96孔板置于 37 ℃、5%CO2培養箱中連續培養44 h，取出后，每孔加入20 μL MTT溶液（稱取MTT 0.005 g，溶于1 mL PBS緩沖液中，搖勻至全部溶解，使其終濃度為 5.0 mg/ mL，0. 22 μm濾膜過濾除菌，20 ℃避光保存）。繼續培養4 h，取出培養板將離心機調整至1 800 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液。振蕩混勻，置于全自動酶標儀570 nm處檢測OD值。結果以增殖指數（PI）的大小，表達小鼠淋巴細胞增殖含量，PI =（實驗組OD值/對照組OD值）×100%

1.2.4 ELISA法檢測大棗多糖對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

參考Xie等[13]實驗方法，上述制備好的淋巴細胞懸液加到24孔板中，每組設置3個復孔，每孔1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，培養2 h后加1 mL不同濃度的大棗多糖溶液，空白組加入1 mL1640完全培養基，再培養48 h。將離心機調至1 500 r/min 4 ℃離心5 min，收集上清液。用ELISA法觀察大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12 mRNA分泌的影響，按照試小鼠白細胞介素細胞因子劑盒說明書進行操作。

1.2.5 大棗多糖對 IL-2、IL-6、IL-10和 IL-12mRNA表達的影響

參考Pan L C等[14]實驗方法，24孔細胞培養板，每孔加入1 mL淋巴細胞懸液，按1.2.2分組方式和分組處理。37 ℃ 5% CO2培養24 h。棄去上清液，用PBS清洗干凈，每管加1 mL Trizol，使細胞完全裂解，換EP管，以12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄沉淀，每管加入200 μL三氯甲烷，用力上下顛倒，并劇烈搖晃震蕩30 s，取出碎冰放在泡沫箱，冰浴10 min。調整離心機以12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液，加入500 μL的異丙醇，上下顛倒8次，放入盛有冰塊的泡沫箱里，冰浴10 min，調整離心機以12 000 r/min，4 ℃離心15 min，仔細棄去上清液，將底部小部分沉淀物小心保留。加入1 mL 75%冰乙醇，上下顛倒混勻，調整離心機以12 000 r/min，4 ℃離心10 min，再棄去上清液后，置于室溫下30 min。加入RNase-free水20 μL使沉淀溶解。取1 μL已經溶解好的RNA溶液，在超微量紫外或者可見分光光度計下調整波長為260/280 nm觀察其吸光度A的比值，并將其total RNA的濃度記下，若比值在1.8～2.1之間，則表明提取的RNA未被污染，且質量好。

根據 NCBI基因庫中相關基因序列，采用Primer 6引物設計軟件設計，如表1所示。

表1 實驗中小鼠IL-2、IL-6、IL10、IL-12和內參ACTB引物序列Table 1 Mouse IL-2,IL-6,IL-10,IL-12 and internal reference ACTB primer sequences in the Experiment

采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒的說明配制反應體系：2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5 μL，引物為 2 μL，cDNA 模板 2 μL，滅菌水為 8.5 μL，總共 25 μL，混合均勻，進行Real time PCR反應，采用擴增試劑盒的程序，將儀器調整為預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s ，調整為40個循環。以ACTB作為內參，擴增完后按照2-ΔΔCt方法進行數據分析從而得到目的基因的相對表達量。

1.2.6 統計學分析

按照（平均數±標準差）表示數據結果。應用SPSS 20.0統計軟件分析實驗結果，數據用(x￣±s)表示，按照單因素方差分析進行觀察，用LSD法表達其顯著性，檢驗水準α=0.05，α=0.01。

2 結果與分析

2.1 大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響

由表 2可知，與空白組相比，陽性對照組淋巴細胞指數顯著升高（P＜0.01），說明淋巴細胞在陽性對照組的加入后，增殖量有所提升；與空白組相比，大棗多糖處理組淋巴細胞指數呈現上升趨勢（P＜0.01），說明大棗多糖能夠刺激淋巴細胞增殖，當大棗多糖濃度在20～160 μg/mL時，淋巴細胞增殖指數隨大棗多糖濃度升高出現顯著上升趨勢，表現出一種良好的劑量-效應關系；當大棗多糖濃度到達320 μg/mL時，淋巴細胞指數反而顯著下降，說明大棗多糖對淋巴細胞增殖呈雙向調節作用。與陽性對照組相比，大棗多糖為20、40、80、320 μg/mL濃度組淋巴細胞指數顯著降低（P＜0.01），當大棗多糖濃度為160 μg/mL時，淋巴細胞指數不存在統計學意義（P＞0.05）。

表2 大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響（x￣±s，n=5）Table 2 Effect of jujube polysaccharide on lymphocyte proliferation (x￣±s, n=5)

2.2 大棗多糖對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

由表3可知，與空白組相比，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12的陽性對照組分泌量顯著升高（P＜0.01），說明陽性對照組能夠誘導細胞因子分泌；與空白組相比，大棗多糖濃度組中細胞因子分泌量呈現上升趨勢（P＜0.01），說明大棗多糖能夠誘導細胞分子分泌；當大棗多糖濃度組在20～160 μg/mL范圍時，淋巴細胞的分泌量隨大棗多糖濃度組濃度的升高呈現上升趨勢，表現出一種良好的劑量-效應關系；當大棗多糖濃度到達320 μg/mL時，淋巴細胞分泌量反而下降，由此可以說明，大棗多糖對誘導細胞因子分泌呈現雙向調節作用。與陽性對照組相比，當大棗多糖濃度為 160 μg/mL時，細胞因子分泌量不存在統計學意義（P＞0.05），其余各濃度組均存在統計學意義（P＜0.01）。

表3 大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12分泌的影響（x￣±s，n=5）Table 3 Effect of jujube polysaccharide on the secretion of IL-2、IL-6、IL-10、IL-12in lymphocytes (x￣±s, n=5)

2.3 大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12mRNA的影響

由表4可知，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12與空白組相比，陽性對照組細胞因子mRNA表達顯著升高（P＜0.01），由此說明，陽性對照組通過增加細胞因子mRNA表達量調節，促進細胞因子的分泌。與空白組相比，大棗多糖濃度組細胞因子mRNA表達顯著升高（P＜0.01），由此說明，大棗多糖通過增加細胞因子mRNA表達量調節，促進細胞因子分泌。當大棗多糖的濃度在 20～160 μg/mL時，細胞因子mRNA表達量隨大棗多糖濃度的升高出現上升的趨勢，表現出一種良好的劑量-效應關系；當大棗多糖濃度達到320 μg/mL時，細胞因子mRNA表達量反而下降，說明大棗多糖對誘導淋巴細胞細胞因子mRNA表達量呈雙向調節作用。與陽性對照組相比，大棗多糖濃度為160 μg/mL時，細胞因子 mRNA表達量不存在統計學意義（P＞0.05），其余各濃度組都存在統計學意義（P＜0.01）。

表4 大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12 mRNA的影響（n=5）Table 4 Effect of jujube polysaccharide on IL-2、IL-6、IL-10 and IL-12 mRNA of lymphocytes (n=5)

3 討論

3.1 大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響

本實驗研究表明，大棗多糖濃度在 20～320 μg/mL范圍內，對小鼠淋巴細胞體外增殖具有促進作用，當大棗多糖濃度為160 μg/mL時效果最佳，與陽性對照組差異不顯著；有效提高小鼠淋巴細胞增殖的能力。眾所周知，脾臟是動物機體重要的外周淋巴器官，脾臟免疫功能的正常發揮與其生長發育和組織結構密切相關，脾臟是由大量的淋巴細胞組成的[15]，因此，可以說脾臟生長發育的優劣取決于脾臟內淋巴細胞的增殖和凋亡。本實驗中，大棗多糖可以使小鼠的淋巴細胞增值率顯著提升，淋巴細胞增殖產生效應淋巴細胞，清除非己抗原，提高機體免疫功能。機體的系統免疫中淋巴細胞增殖是機體對非己抗原刺激產生免疫應答過程中的關鍵一步。淋巴細胞增殖效果決定了機體免疫應答反應的強度，反應機體的細胞免疫狀態[16]。

3.2 大棗多糖對淋巴細胞 IL-2、IL-6、IL-10和IL-12分泌及mRNA表達的影響

機體的免疫細胞可以通過分泌細胞因子來發揮免疫作用，本研究主要測定了淋巴細胞幾個重要細胞因子 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12的分泌。大棗多糖可濃度依賴性增加淋巴細胞中細胞因子IL-2的濃度，作用于免疫細胞，包括T細胞、大顆粒淋巴細胞、單核細胞、B細胞等，促進細胞增殖和分泌細胞因子以及Th0和CTL的增殖。研究發現菜籽多糖體外可促進小鼠脾淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ m RNA 的表達[17]。大棗多糖可使淋巴細胞分泌細胞因子IL-6水平成濃度依賴性升高，誘導B細胞分化產生免疫球蛋白，促進T細胞增殖生長，增強血細胞的分化及其抗瘤效應，促進骨髓造血干細胞增殖，IL-6可以上調STAT3介導的維甲酸，促進CD4+幼T細胞向Th17細胞轉化[18]。大棗多糖可濃度依賴性增加淋巴細胞中細胞因子IL-10的濃度，對于T細胞、NK細胞、B細胞、單核巨噬細胞和肥大細胞起抑制作用，為T細胞發育的輔動生長因子、刺激抗體激活 B細胞快速生長和分化，T細胞產生的IL-10可以作為抗炎因子，在疾病中發揮其抗炎鎮靜作用，黃芪多糖可抑制高糖狀態下HMCs細胞過度增殖，下調高糖狀態下HMCs細胞IL-8 mRNA及蛋白的表達，上調IL-l0 mRNA及蛋白的表達，可能通過減輕炎癥反應對 DN腎臟起到保護作用[19]。大棗多糖可濃度依賴性增加淋巴細胞中細胞因子IL-12的濃度，誘導受刺激的T細胞增殖，與IL-2 有協同作用，增加NK細胞活性，促進T輔助細胞1（TH1）的增殖，IL-12促進Th0向Th1分化，IL-12在誘導時產生 Th1，使 Th2轉化為Th1，在Th細胞亞群的平衡中起著關鍵性作用，中藥復方多糖能不同程度的促進各 MHC B-LβⅡ基因型IL-2、IL-4、IL-12 mRNA的表達[20]。本實驗研究發現大棗多糖的濃度依賴性增加淋巴細胞中的 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12的濃度，通過調控 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 mRNA表達，最終達到細胞因子的分泌量，提高機體免疫功能。

4 結論

大棗多糖在小鼠淋巴細胞體外免疫活性中起著重要的作用，大棗多糖在 20～320 μg/mL范圍內，小鼠淋巴細胞體外增殖顯著增加，通過上調IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 mRNA表達量實現免疫活性的提高，促進IL-2、IL-6、IL-10和IL-12細胞因子的分泌，增強了機體的免疫功能，更好的保障人類的健康。