大棗多糖對小鼠淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究

李鳳嬌，李敬雙，王一倫，金 鑫，李 賢，于 洋?

（錦州醫(yī)科大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

大棗（Ziziphus jujuba Mill），鼠李科植物棗的干燥成熟果實，主要分布在亞洲和美洲的熱帶和亞熱帶，少數(shù)分布在非洲和兩半球溫帶，大棗味美甘甜，營養(yǎng)價值豐富，我國已有幾千年的栽培歷史，大棗也是脾胃虛弱、氣血不足、倦怠無力、失眠多夢等患者良好的保健營養(yǎng)品。此外，大棗對慢性肝炎、肝硬化、貧血、過敏性紫癜等病癥有較好療效，典型的藥食同源之品。

大棗多糖（Jujube polysaccharide，JP）是大棗中一種重要的活性物質(zhì)，具有多種生理活性，將其提取、純化、分級[1]，可作為免疫促進劑。大棗多糖能控制細胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細胞的生長與衰老[2]；能有效清除人體內(nèi)的氧自由基[3]。大棗多糖是抗衰老的主要活性成分，具有明顯抗補體活性，且中性多糖的活性要強于酸性多糖。研究發(fā)現(xiàn)，大棗多糖具有抗氧化活性[4]、免疫調(diào)節(jié)活性[5]、保肝作用[6]、抗高脂血癥作用[7]、抗腫瘤作用[8]、減緩疲倦[9]。可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品及功能食品，作為綠色生物醫(yī)藥產(chǎn)品，大棗多糖具有廣闊的市場前景和應(yīng)用價值。

隨時代的進步，關(guān)于大棗多糖的造血功能、抗氧化功能、修復(fù)肝損傷、抗疲勞、改善腸道、抑制腫瘤細胞等的報道越來越多，大棗多糖毒性低，不良反應(yīng)少，為了廣泛應(yīng)用于臨床和保健食品，大棗多糖的抗癌、抗氧化和增強免疫力的研究仍將是未來研究重點，因此，進一步探討其作用機制對于為大棗多糖的深入研究、飼料添加劑的研制和開發(fā)具有重要意義。

本文以大棗多糖為研究對象，建立免疫模型，通過 MTT法觀察大棗多糖對小鼠淋巴細胞增殖的影響；ELISA法觀察大棗多糖對小鼠淋巴細胞上清液中IL-2、IL-6、IL-10、IL-12水平的影響；QRT-PCR檢測大棗多糖對小鼠淋巴細胞 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12信使核糖核酸（mRNA）的表達，為大棗多糖的進一步開發(fā)與利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Balb/c小鼠 SPF級，體重在（20±2）g，8～10周齡，飼養(yǎng)條件20～26 ℃，錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院，生產(chǎn)許可證號為SCXK (遼)2014～0004。

1.1.2 藥品

大棗多糖，純度≥90%：晨光生物技術(shù)有限公司；四季青優(yōu)級胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；甲基噻唑藍298-93-1（MTT）、臺盼藍（Trypan Blue）、RPMI-1640培養(yǎng)基-11875、二甲基亞砜 D8370-100（DMSO）、紅細胞裂解液（Tris-NH4Cl）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和氯仿-P1014：北京索萊寶科技有限公司；Trizol-R0016：碧云天生物技術(shù)；異丙醇、乙醇：山東旭晨化工科技有限公司；小鼠IL-2、IL-6、IL-10和IL-12 mRNA細胞因子檢測試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus）試劑盒RT-PCR試劑盒RR047A TAKARA、QPCR試劑盒RR820A TAKARA：寶生物工程有限公司。

1.1.3 儀器

Varioskan FlashT多功能酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作 SW-CJ-1F型：蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡 CKX41SF：日本OLYMPUS公司；低速離心機 TD5A：湖南赫西儀器裝備有限公司；96孔或24孔板臺式離心機：上海安亭(TDL80-2B)；CO2培養(yǎng)箱：日本SHELLAB；FA2004N型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Mastercyler ep realplex4型實時熒光定量PCR儀、AG 22331 Hamburg型PCR擴增儀、BioPhotometer plus型蛋白核酸分析儀：德國 Eppendorf公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)：中國Tanon 2500。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞懸液的制備

參考桑卡娜等[10]、馬玉芳等[11]實驗方法，頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠身體浸泡在75%酒精3 min消毒，注意不要將小鼠口鼻浸入酒精，將浸泡后的小鼠放在培養(yǎng)皿中移到無菌超凈工作臺內(nèi)取出脾臟，放于盛有磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的平皿中沖洗干凈，將脾臟用10 mL注射器拉桿柄尾部將其磨碎，使脾臟通過200目濾網(wǎng)浸入1640培養(yǎng)基中。收集全部的細胞懸液于離心管中吹勻，將離心機調(diào)整至1 500 r/min 4 ℃，離心5 min，將上清液棄去，使用移液槍將紅細胞裂解液（Tris-NH4Cl）滴加3 mL至大離心管中吹勻重懸，靜置5 min，離心5 min，棄去上清液，若離心管中仍存在紅細胞，重復(fù)操作至紅細胞完全裂解。加入適量 RPMI-1640完全培養(yǎng)基（胎牛血清3 mL，1640 27 mL，配成30 mL的完全培養(yǎng)基）重懸沉淀細胞，離心棄上清，取900 μL細胞懸液置于EP管內(nèi)，加100 μL臺盼藍（Trypan Blue）溶液，染色計數(shù)細胞活力，混勻后，吸出少量混合液放在計數(shù)板上，在顯微鏡下倒置觀察，調(diào)整直至細胞活力≥95%。用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，得到淋巴細胞懸液。

1.2.2 分組方式和分組處理

由于我國目前的司法改革主要以借鑒美國法律為趨勢，而德國是較早且較為細致地將技術(shù)偵查法治化的國家[4]，我國法律對上述問題并無明文規(guī)定，因此本文先介紹美國通訊監(jiān)察法的相關(guān)規(guī)定，并與大陸法系的德國法進行比較，以便為我國立法及司法實務(wù)的運作提供參考，之后在詳細分析我國刑事訴訟法有關(guān)該制度規(guī)定所存在的主要問題的基礎(chǔ)上，提出構(gòu)建偶然監(jiān)聽所得材料的證據(jù)能力規(guī)則的具體建議。

設(shè)置空白組，陽性對照組（左旋咪唑），大棗多糖組（終濃度為 20、40、80、160、320 μg/mL），空白組孔中加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基，大棗多糖組加入不同濃度的大棗多糖溶液，陽性對照組加入左旋咪唑。

1.2.3 MTT法檢測大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響

參考張思哲等[12]實驗方法，上述制備好的淋巴細胞懸液加到96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，每孔 100 μL，將加入淋巴細胞的培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，2 h后加藥。將96孔板置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)44 h，取出后，每孔加入20 μL MTT溶液（稱取MTT 0.005 g，溶于1 mL PBS緩沖液中，搖勻至全部溶解，使其終濃度為 5.0 mg/ mL，0. 22 μm濾膜過濾除菌，20 ℃避光保存）。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板將離心機調(diào)整至1 800 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液。振蕩混勻，置于全自動酶標(biāo)儀570 nm處檢測OD值。結(jié)果以增殖指數(shù)（PI）的大小，表達小鼠淋巴細胞增殖含量，PI =（實驗組OD值/對照組OD值）×100%

1.2.4 ELISA法檢測大棗多糖對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

參考Xie等[13]實驗方法，上述制備好的淋巴細胞懸液加到24孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 h后加1 mL不同濃度的大棗多糖溶液，空白組加入1 mL1640完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h。將離心機調(diào)至1 500 r/min 4 ℃離心5 min，收集上清液。用ELISA法觀察大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12 mRNA分泌的影響，按照試小鼠白細胞介素細胞因子劑盒說明書進行操作。

1.2.5 大棗多糖對 IL-2、IL-6、IL-10和 IL-12mRNA表達的影響

參考Pan L C等[14]實驗方法，24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入1 mL淋巴細胞懸液，按1.2.2分組方式和分組處理。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。棄去上清液，用PBS清洗干凈，每管加1 mL Trizol，使細胞完全裂解，換EP管，以12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄沉淀，每管加入200 μL三氯甲烷，用力上下顛倒，并劇烈搖晃震蕩30 s，取出碎冰放在泡沫箱，冰浴10 min。調(diào)整離心機以12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液，加入500 μL的異丙醇，上下顛倒8次，放入盛有冰塊的泡沫箱里，冰浴10 min，調(diào)整離心機以12 000 r/min，4 ℃離心15 min，仔細棄去上清液，將底部小部分沉淀物小心保留。加入1 mL 75%冰乙醇，上下顛倒混勻，調(diào)整離心機以12 000 r/min，4 ℃離心10 min，再棄去上清液后，置于室溫下30 min。加入RNase-free水20 μL使沉淀溶解。取1 μL已經(jīng)溶解好的RNA溶液，在超微量紫外或者可見分光光度計下調(diào)整波長為260/280 nm觀察其吸光度A的比值，并將其total RNA的濃度記下，若比值在1.8～2.1之間，則表明提取的RNA未被污染，且質(zhì)量好。

根據(jù) NCBI基因庫中相關(guān)基因序列，采用Primer 6引物設(shè)計軟件設(shè)計，如表1所示。

表1 實驗中小鼠IL-2、IL-6、IL10、IL-12和內(nèi)參ACTB引物序列Table 1 Mouse IL-2,IL-6,IL-10,IL-12 and internal reference ACTB primer sequences in the Experiment

采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒的說明配制反應(yīng)體系：2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5 μL，引物為 2 μL，cDNA 模板 2 μL，滅菌水為 8.5 μL，總共 25 μL，混合均勻，進行Real time PCR反應(yīng)，采用擴增試劑盒的程序，將儀器調(diào)整為預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s ，調(diào)整為40個循環(huán)。以ACTB作為內(nèi)參，擴增完后按照2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析從而得到目的基因的相對表達量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

按照（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示數(shù)據(jù)結(jié)果。應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果，數(shù)據(jù)用(x￣±s)表示，按照單因素方差分析進行觀察，用LSD法表達其顯著性，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，α=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響

由表 2可知，與空白組相比，陽性對照組淋巴細胞指數(shù)顯著升高（P＜0.01），說明淋巴細胞在陽性對照組的加入后，增殖量有所提升；與空白組相比，大棗多糖處理組淋巴細胞指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.01），說明大棗多糖能夠刺激淋巴細胞增殖，當(dāng)大棗多糖濃度在20～160 μg/mL時，淋巴細胞增殖指數(shù)隨大棗多糖濃度升高出現(xiàn)顯著上升趨勢，表現(xiàn)出一種良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)大棗多糖濃度到達320 μg/mL時，淋巴細胞指數(shù)反而顯著下降，說明大棗多糖對淋巴細胞增殖呈雙向調(diào)節(jié)作用。與陽性對照組相比，大棗多糖為20、40、80、320 μg/mL濃度組淋巴細胞指數(shù)顯著降低（P＜0.01），當(dāng)大棗多糖濃度為160 μg/mL時，淋巴細胞指數(shù)不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響（x￣±s，n=5）Table 2 Effect of jujube polysaccharide on lymphocyte proliferation (x￣±s, n=5)

2.2 大棗多糖對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

由表3可知，與空白組相比，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12的陽性對照組分泌量顯著升高（P＜0.01），說明陽性對照組能夠誘導(dǎo)細胞因子分泌；與空白組相比，大棗多糖濃度組中細胞因子分泌量呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.01），說明大棗多糖能夠誘導(dǎo)細胞分子分泌；當(dāng)大棗多糖濃度組在20～160 μg/mL范圍時，淋巴細胞的分泌量隨大棗多糖濃度組濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，表現(xiàn)出一種良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)大棗多糖濃度到達320 μg/mL時，淋巴細胞分泌量反而下降，由此可以說明，大棗多糖對誘導(dǎo)細胞因子分泌呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用。與陽性對照組相比，當(dāng)大棗多糖濃度為 160 μg/mL時，細胞因子分泌量不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余各濃度組均存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12分泌的影響（x￣±s，n=5）Table 3 Effect of jujube polysaccharide on the secretion of IL-2、IL-6、IL-10、IL-12in lymphocytes (x￣±s, n=5)

2.3 大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12mRNA的影響

由表4可知，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12與空白組相比，陽性對照組細胞因子mRNA表達顯著升高（P＜0.01），由此說明，陽性對照組通過增加細胞因子mRNA表達量調(diào)節(jié)，促進細胞因子的分泌。與空白組相比，大棗多糖濃度組細胞因子mRNA表達顯著升高（P＜0.01），由此說明，大棗多糖通過增加細胞因子mRNA表達量調(diào)節(jié)，促進細胞因子分泌。當(dāng)大棗多糖的濃度在 20～160 μg/mL時，細胞因子mRNA表達量隨大棗多糖濃度的升高出現(xiàn)上升的趨勢，表現(xiàn)出一種良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)大棗多糖濃度達到320 μg/mL時，細胞因子mRNA表達量反而下降，說明大棗多糖對誘導(dǎo)淋巴細胞細胞因子mRNA表達量呈雙向調(diào)節(jié)作用。與陽性對照組相比，大棗多糖濃度為160 μg/mL時，細胞因子 mRNA表達量不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余各濃度組都存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表4 大棗多糖對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-10和IL-12 mRNA的影響（n=5）Table 4 Effect of jujube polysaccharide on IL-2、IL-6、IL-10 and IL-12 mRNA of lymphocytes (n=5)

3 討論

3.1 大棗多糖對淋巴細胞增殖的影響

本實驗研究表明，大棗多糖濃度在 20～320 μg/mL范圍內(nèi)，對小鼠淋巴細胞體外增殖具有促進作用，當(dāng)大棗多糖濃度為160 μg/mL時效果最佳，與陽性對照組差異不顯著；有效提高小鼠淋巴細胞增殖的能力。眾所周知，脾臟是動物機體重要的外周淋巴器官，脾臟免疫功能的正常發(fā)揮與其生長發(fā)育和組織結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，脾臟是由大量的淋巴細胞組成的[15]，因此，可以說脾臟生長發(fā)育的優(yōu)劣取決于脾臟內(nèi)淋巴細胞的增殖和凋亡。本實驗中，大棗多糖可以使小鼠的淋巴細胞增值率顯著提升，淋巴細胞增殖產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細胞，清除非己抗原，提高機體免疫功能。機體的系統(tǒng)免疫中淋巴細胞增殖是機體對非己抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵一步。淋巴細胞增殖效果決定了機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的強度，反應(yīng)機體的細胞免疫狀態(tài)[16]。

3.2 大棗多糖對淋巴細胞 IL-2、IL-6、IL-10和IL-12分泌及mRNA表達的影響

機體的免疫細胞可以通過分泌細胞因子來發(fā)揮免疫作用，本研究主要測定了淋巴細胞幾個重要細胞因子 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12的分泌。大棗多糖可濃度依賴性增加淋巴細胞中細胞因子IL-2的濃度，作用于免疫細胞，包括T細胞、大顆粒淋巴細胞、單核細胞、B細胞等，促進細胞增殖和分泌細胞因子以及Th0和CTL的增殖。研究發(fā)現(xiàn)菜籽多糖體外可促進小鼠脾淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ m RNA 的表達[17]。大棗多糖可使淋巴細胞分泌細胞因子IL-6水平成濃度依賴性升高，誘導(dǎo)B細胞分化產(chǎn)生免疫球蛋白，促進T細胞增殖生長，增強血細胞的分化及其抗瘤效應(yīng)，促進骨髓造血干細胞增殖，IL-6可以上調(diào)STAT3介導(dǎo)的維甲酸，促進CD4+幼T細胞向Th17細胞轉(zhuǎn)化[18]。大棗多糖可濃度依賴性增加淋巴細胞中細胞因子IL-10的濃度，對于T細胞、NK細胞、B細胞、單核巨噬細胞和肥大細胞起抑制作用，為T細胞發(fā)育的輔動生長因子、刺激抗體激活 B細胞快速生長和分化，T細胞產(chǎn)生的IL-10可以作為抗炎因子，在疾病中發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)靜作用，黃芪多糖可抑制高糖狀態(tài)下HMCs細胞過度增殖，下調(diào)高糖狀態(tài)下HMCs細胞IL-8 mRNA及蛋白的表達，上調(diào)IL-l0 mRNA及蛋白的表達，可能通過減輕炎癥反應(yīng)對 DN腎臟起到保護作用[19]。大棗多糖可濃度依賴性增加淋巴細胞中細胞因子IL-12的濃度，誘導(dǎo)受刺激的T細胞增殖，與IL-2 有協(xié)同作用，增加NK細胞活性，促進T輔助細胞1（TH1）的增殖，IL-12促進Th0向Th1分化，IL-12在誘導(dǎo)時產(chǎn)生 Th1，使 Th2轉(zhuǎn)化為Th1，在Th細胞亞群的平衡中起著關(guān)鍵性作用，中藥復(fù)方多糖能不同程度的促進各 MHC B-LβⅡ基因型IL-2、IL-4、IL-12 mRNA的表達[20]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)大棗多糖的濃度依賴性增加淋巴細胞中的 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12的濃度，通過調(diào)控 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 mRNA表達，最終達到細胞因子的分泌量，提高機體免疫功能。

4 結(jié)論

大棗多糖在小鼠淋巴細胞體外免疫活性中起著重要的作用，大棗多糖在 20～320 μg/mL范圍內(nèi)，小鼠淋巴細胞體外增殖顯著增加，通過上調(diào)IL-2、IL-6、IL-10、IL-12 mRNA表達量實現(xiàn)免疫活性的提高，促進IL-2、IL-6、IL-10和IL-12細胞因子的分泌，增強了機體的免疫功能，更好的保障人類的健康。